Marksist Devlet Kuramı ve Burjuva Devletinin Çelişik Karakteri

A cromatografia de exclusão molecular da sPLA, sPLA:PS e PS foi realizada sob as mesmas condições de tampão, temperatura e fluxo, monitoradas a 280 nm para as três espécies testadas com a sPLA2. A Figura 17 mostra o perfil cromatográfico da sPLA2 e o produto da incubação sPLA2 com a B. occidentalis (PSBo). O perfil cromatográfico da enzima nativa mostra seu tempo de eluição aos 14 minutos (Figura 17B), no entanto, o produto da incubação apresenta um tempo de eluição menor em relação à enzima nativa, indicando aumento da massa molecular. Este aumento de massa pode estar relacionado com a interação eletrostática entre as cargas dos compostos incubados. Além disso, a base do pico de eluição aumentou em relação ao pico da sPLA2 nativa, o que pode indicar agregação das moléculas devido à associação entre cargas negativas do açúcar e as cargas positivas da sPLA2.

Figura 17. Perfil cromatográfico em HPLC com coluna de exclusão molecular TSKGel

G3000SWXL (0.78 x 30 cm), previamente equilibrada com solução tampão Tris-HCl (1M, pH 7.8), monitoradas a 280 nm e com fluxo de 1.0mL/min. Em A) Perfil cromatográfico do produto da incubação de sPLA2:BoSP. B) Perfil cromatográfico da sPLA2 nativa.

Este diferença entre as cargas das moléculas é capaz de aproximar suficientemente o PS da sPLA2 e mudar o estado de ação da enzima. A manutenção da intensidade detectada à 280 nm em ambas as corridas pode indicar que não houve mudança conformacional ao ponto de mudar o microclima do triptofano, porém, os demais dados

fornecidos pelo perfil indicam uma aproximação entre as moléculas e a mudança de massa (XIMENIS et al., 2012).

Figura 18. Perfil cromatográfico em HPLC com coluna de exclusão molecular TSKGel

G3000SWXL (0.78 x 30 cm), previamente equilibrada com solução tampão Tris-HCl (1M, pH 7.8), monitoradas a 280 nm e com fluxo de 1.0 mL/min. Perfis cromatográficos de CiSP purificado e o produto de incubação de sPLA2:CiSP, em rosa e azul, respectivamente.

A Figura 18 apresenta o perfil de cromatografia para o PS da C. isthmocladum incubado com a sPLA2. Observamos que a fração inicial, ou seja, a fração de maior peso molecular (PSCi1) não sofreu alteração ao longo da corrida, pois seu tempo de retenção continua o mesmo em ambos os casos. A segunda fração, PSCi2, revela uma interação com a sPLA2 pois a base do pico sofreu distorções característica de interação. Tal dado pode indicar a formação de um complexo molecular por interação de cargas uma vez que não há indícios de forte mudança conformacional da sPLA2. Esse resultado corrobora o apresentado na Figura 11A onde a fração de menor massa de PS foi a que inibiu significativamente a sPLA2 nos teste in vitro. Codium fragile atlanticum apresentou PS

com propriedades antitrombóticas que variavam de acordo com o tamanho da molécula, tanto PS de alta massa molecular quanto de baixa, eles inibiram a atividade enzimática da trombina e do fator Xa (VALENTIN et al., 2000; LAMBEAU et al., 2008).

Figura 19. Perfil cromatográfico em HPLC com coluna de exclusão molecular TSKGel

G3000SWXL (0.78 x 30 cm), previamente equilibrada com solução tampão Tris-HCl (1M, pH ι.κ), monitoradas a 280 nm e com fluxo de 1.0mL/min. Perfis cromatográficos de CrSP purificado (em vermelho), sPLA2 nativa e o produto de incubação de sPLA2:CrSP.

As bases estruturais desta interação são complexas e dependem da distribuição dos grupos sulfatos e da composição mono ou dissacarídica do açúcar (RODRIGUES et al., 2009). Nossos resultados seguem essa linha uma vez que são diferentes para os PS das macroalgas estudadas e que a massa molecular parece ser crítica para a modulação das funções biológicas e farmacológicas da sPLA2 (TOYAMA et al., 2010).

As análises cromatográficas de PSCr, sPLA2:PSCr e sPLA2 nativa foram realizadas sob as mesmas condições de corrida tais como, temperatura, fluxo, tampão, comprimento de onda (280 nm) e concentração e, os resultados das corridas cromatográficas se encontram na Figura 19. A Figura 19A indica o perfil cromatográfico do polissacarídeo com tempo de eluição em aproximadamente dezenove minutos. A Figura 19B mostra a sPLA2 nativa pura com seu único pico em dezessete minutos, enquanto que o perfil cromatográfico de sPLA2:PSCr mostra o início da eluição em doze minutos (Figura 19C). Como citado anteriormente, a coluna usada na cromatografia foi a exclusão molecular - SEC, ou seja, os componentes são selecionados pela matriz de acordo com a massa da molécula. Desta forma, vemos que houve uma agregação entre o açúcar e a enzima que se torna evidente pelo aumento da massa e, consequentemente, menor tempo de retenção. Como apresentado anteriormente, o PSCr pode ter uma massa molecular de aproximadamente 14kDa bem como a sPLA2, com isso, possivelmente, o produto da incubação contem massa molecular com aproximadamente 30kDa.

Ghosh e colaboradores (2004) estudaram o efeito do PS da macroalga verde

Caulerpa racemosa coletada na costa arábica e testaram seu extrato, observando sua

propriedade anti-herpética. Posteriormente, estudo conduzido pelo mesmo grupo testou o PS com o vírus tipo II da dengue (PUJOL et al., 2012). O PS da C. racemosa foi extraído por água quente e mostrou ser um açúcar com uma composição heterogênea de galactose, glucose, arabnose e xilose, junto com algumas porções de manose e ramnose como componentes minoritários, o que caracteriza este PS como um heteropolissacarídeo. Os autores somaram ao método de extração a técnica de cromatográficas com coluna de exclusão molecular para o fracionamento e purificação do heteropolissacarídeo (PUJOL et al., 2012). Dentro de todos os compostos derivados das macroalgas testadas pelos autores, o composto mais ativo contra o vírus da dengue foi a galactana, seguido de xilomanas e o polissacarídeo heterogêneo da C. racemosa cujo potencial antiviral dos açucares parecem depender da posição do grupo sulfato, composição e massa molecular (DAMONTE et al., 2004; GHOSH et al., 2004). Além disso, a interferência da absorção viral confirma a

atividade antiviral na qual o PS bloqueia a ligação viral com os proteoglicanos encontrados na célula hospedeira (DAMONTE et al 2004).

Existe evidencias que apontam que o PS é capaz de se ligar à proteínas através de vários mecanismos diferentes. Eles podem se ligar de forma não especifica com uma região básica na superfície das proteínas por interação iônica e tal interação pode não ser fisiologicamente significante (MULLOY et al., 2005). A interação molecular com os PS derivados de alga com a sPLA2 não é ainda muito estudada, mas sabe-se que a sPLA2 tem resíduos de aminoácidos básicos na porção N-terminal, C-terminal e por fora da estrutura em α-hélice (OLIVEIRA et al., 2002). Nossos resultados mostram que a ligação entre a sPLA2 e PS pode ocorrer devido a interação entre a região da proteína com aminoácido básicos com os grupamentos sulfatos contidos no açúcar.

A atividade enzimática das sPLA2 é um evento crucial para o desenvolvimento de atividades biológicas e farmacológicas destas proteínas. A ação enzimática da sPLA2 nos fosfolipídios de membrana pode gerar dois produtos do Ácido Araquidônico e fosfolipídios de membrana. Esses dois compostos estão envolvidos no início da inflamação, aumentando a permeabilidade vascular e o recrutamento de células inflamatórias. Há evidencias que estes lipídios biologicamente ativos podem agir como segundo mensageiros atuando em nível celular e também participando do evento inflamatório. Além disso, o Ácido Araquidônico também estão envolvidos na atividade neutóxica da sPLA2 do veneno da serpente. Estudos conduzidos por Rigoni e colaboradores (2005) mostraram que a eficácia da neurotoxina depende da hidrólise do fosfolipídio, lisofosfolipídios e ácidos graxos que modulam a sPLA2.