3. MATERYAL VE METOT
3.3. Pamuk Yağından DNA İzolasyonu
3.3.1. Pamuk Yağından CTAB-Hekzan-Kloroform Yöntemiyle DNA İzolasyon Protokolü (Protokol 1)
20
Bu protokol Raieta ve ark. (2015) tarafından yapılmış çalışmadan alındı.
1. 2 mL’lik tüp içerisine 300 µL önceden ısıtılmış %2’lik CTAB tampon çözeltisi, 300 µL hekzan ve 300 µL pamuk yağı eklendi ve tüp ters düz edilerek karıştırıldı.
2. Tüp 1 saat 20°C’de 14000 rpm’de santrifüjlendi.
3. Yağ fazı atıldı ve sulu faz 65°C’de 30 dakika inkübe edildi.
4. İnkübasyondan sonra sulu faz 15 dakika 20°C’de 14000 rpm’de santrifüjlendi. Sıvı faz ayrı bir tüpe alındı.
5. Pelet 200 µL 0,5% CTAB tampon çözeltisi ve 200 µL fenol içerisinde çözüldü. 6. Karışım 15 dakika 20°C’de 14000 rpm’de santrifüjlendi. Sıvı faz ayrı bir tüpe alındı. 7. Sıvı faza kloroform:izoamil alkol (24:1) eklendi ve 15 dakika 4°C’de 14000 rpm’de
santrifüjlendi.
8. Sıvı faza 2,5 katı kadar soğuk etanol, 0,1 katı kadar amonyum asetat çözeltisi ve 10 µg/mL glikojen eklendi ve tüp ters düz edilerek karıştırıldı.
9. Karışım bir gece -20°C’de inkübe edildi.
10. İnkübasyondan sonra karışım 15 dakika 20°C’de 14000 rpm’de santrifüjlendi. Sıvı faz ayrı bir tüpe alındı.
11. Pelet iki kere 500 µL %70’lik (h/h) etanol ile yıkandı. Santrifüjlendikten sonra kurutuldu.
1. Kuruyan pelet 50 µL steril saf su içerisinde çözüldü. DNA çözeltisi buzdolabında -20°C’de saklandı.
3.3.2 Pamuk Yağından CTAB-Merkaptoetanol Yöntemiyle DNA İzolasyonProtokolü(Protokol 2)
Bu protokol Busconi ve ark. (2003) tarafından yapılmış çalışmadan alındı.
1. 50-100 mL pamuk yağı örnekleri 4°C’de 14000 g’de 30 dakika yaklaşık 0,5 mL ıslak pelet elde edilene kadar santrifüjlendi.
2. Süpernatant atıldı ve ıslak pelet 2 mL’lik tüpe aktarıldı.
3. Tüp 4°C’de 14000 g’de 15 dakika tekrar santrifüjlendi ve yağlı süpernatant dikkatlice atıldı.Pelet sıvı nitrojen ile donduruldu.
4. Daha sonra tüp hemen önceden 65°C’de ısıtılmış su banyosuna daldırıldı. Bu dondur- çöz işlemi iki kere tekrar edildi.
21
6. Pelet eklenen tampon çözelti içerisinde vortekslemeden çözüldü ve 65°C’de 1.5 saat inkübe edildi. İnkübasyon süresi boyunca her 10 dk’da bir yavaşça karıştırıldı.
7. Tüpe 750 µLkloroform:oktanol (24:1 v:v) eklendi ve tüp ters düz edilerek oda sıcaklığında 5 dk karıştırıldı.
8. Tüp oda sıcaklığında 14000 g’de 10 dakika santrifüjlendi ve süpernatant temiz bir tüpe aktarıldı.
9. Tüpe tekrar 750 µLkloroform:oktanol (24:1 v:v) eklendi. Tüp ters düz edilerek oda sıcaklığında 5 dk karıştırıldı, 14000 g’de 10 dakika santrifüjlendi ve süpernatant temiz bir tüpe aktarıldı.
10. 75 µL suda çözülmüş %10’luk CTAB süpernatant üzerine eklendi ve 5 dk karıştırıldı. 11. Tüpe 1.5 hacim katı kadar CTAB presipitasyon çözeltisi eklendi ve 10 dk ters-düz
edilerek karıştırıldı.
12. Tüp oda sıcaklığında 14000 g’de 20 dakika santrifüjlendi ve süpernatant atıldı.
13. Pelet oda sıcaklığında 15-30 dk kurutuldu. Daha sonra 100 µL tuz çözeltisi eklenerek 37°C’de bir saat inkübe edildi.
14. Tüpe 750 µLkloroform:oktanol (24:1 v:v) eklendi ve tüp ters düz edilerek oda sıcaklığında 5 dk karıştırıldı.
15. Tüp oda sıcaklığında 14000 g’de 10 dakika santrifüjlendi ve süpernatant temiz bir tüpe aktarıldı.
16. Süpernatantın 2.5 hacim katı kadar soğuk saf etanol eklendi. Tüp ters-düz edilerek karıştırıldı.
17. Tüp 4°C’de 14000 g’de 15 dakika santrifüjlendi ve üst faz atıldı.
18. Pelet üzerine 1 mL %70’lik etanol eklendi ve tüp 4°C’de 14000 g’de 5 dakika santrifüjlendi.
19. Süpernatant atıldı ve pelet oda sıcaklığında birkaç dakika kurutuldu.
20. Pelet 30-50 µLsteril saf içinde çözüldü ve 65°C’de 10-30 dakika inkübe edildi.
21. Tüp 14000 g’de 5 dakika santrifüjlendi ve süpernatant temiz bir tüpe aktarıldı. Pelet atıldı. DNA çözeltisi buzdolabında -20°C’de saklandı.
3.3.3. Pamuk Yağında CTAB Yöntemiyle DNA İzolasyon Protokolü (Protokol 3) 1. Örnekten 300 mL steril 1,5’lik mikrosantrifüj tüpe aktarıldı.300 mL steril deiyonize su
eklendi ve ters düz ederek karıştırıldı.
2. 500 mL CTAB-tampon çözeltisi çözeltisieklendi ve karıştırıldı. 3. Karışım 16000x g’de 10 dakika santrifüjlendi.
22
4. Süpernatant 500mL kloroform içeren bir mikro santrifüj tüpüne eklendi,30 saniye karıştırıldı.
5. Faz ayrılına kadar 16000x g’de 5 dakika santrifüjlendi.Üst tabaka yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktatırıldı.
6. 2 hacim CTAB presipitasyon çözeltisi eklendi ve pipet ilekarıştırıldı.60 dakika oda sıcaklığında inkübe edildi.
7. 16000 x g’de 10 dakika santrifülendi.Süpernatant atıldı.
8. Pelet 350 mL tuz çözeltisinde çözüldü. 350mL kloroform eklendi ve 30 saniye çalkalandı.
9. Faz ayrılana kadar 16000x g’de 10 dakika santrifüjlendi. 10. Üst tabaka yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarıldı. 11. 0,6 hacim izopropanol eklendi ve çalkalandı.
12. 16000x g’ de 10 dakika santrifüjlendi ve süpernatant atıldı. 13. Pelete 500 mL %70 ‘lik etonel eklendi ve dikkatlice karıştırıldı. 14. 16000x g’ de 10 dakika santrifüjlendi ve süpernatant atıldı.
15. Pelet kurutuldu ve 50 µL saf suda içerisinde çözüldü.DNA çözeltisi buzdolabında -20°C’de saklandı.
3.3.4.Pamuk Yağından DNA İzolasyonKitiile DNA İzolasyon Protokolü
Bu basamakta innuPrep Food DNA Kit (Analytikjena, Almanya) kullanıldı.InnuPure® C16 touch otomatik DNA izolasyon cihazı kullanılarak DNA izolasyonu yapıldı.Kit protokolüne göre uygulanan işlemler aşağıda belirtildi.
1. 200 mg gıda örneği tartılarak 2 mL’lik tüplere konuldu.
2. Üzerine 0,5 mL liziz çözelti (lysis solutuion CBV) ve 20 µL proteinaz K eklenerek karıştırıldı ve 65°C’de 1 saat inkübe edildi.
3. İnkübasyon sonrası tüpler 11.000 x g ‘de 10 dakika santrifüj edildi. Süpernatant temiz bir tüpe aktarıldı.
4. Kitle birlikte gelen ve Şekil 3-1’de gösterilen çözelti tüpleri Çizelge 3-1’de belirtildiği gibi hazırlandı.
5. 400 µL lisis çözeltisi içerisinde örnek üçüncü hazneye eklendi.
6. Çözelti tüpleri InnuPure C16 touch örnek tepsisine yerleştirildi ve cihaza yüklendi. 7. Cihaz yazılımından uygun protokol belirlendi ve başlatıldı.
23
8. Protokol tamamlandıktan sonra içerisinde DNA olması beklenen tüpler alındı ve kapakları kapatıldı.
9. Tüpler buzdolabında -20°C’de saklandı.
Şekil 3- 1Kit ile gelen hazır çözelti tüpleri (Reagent plate E)
Reaktif Hazneleri
Reaktifler Reaktif Hazneleri
Reaktifler Hazne 1 Manyetik parçalar Hazne 7 Yıkama çözeltisi
Hazne2 Boş Hazne8 Yıkama çözeltisi
Hazne3 Boş Hazne9 Yıkama çözeltisi
Hazne4 Boş Hazne10 Yıkama çözeltisi
Hazne5 Boş Hazne11 Boş
Hazne 6 Bağlanma çözeltisi Hazne 12 Elüsyon tampon çözeltisi
Çizelge 3- 1Reagent plate E’de bulunan reaktif hazneleri ve reaktifler
3.3.5. Etanol ile çöktürme işlemi
Pamuk yağından her bir yöntemle izole edilen DNA’lar birleştirildi ve etanol çöktürme işlemi ile çöktürüldü.Bu basamak için aşağıda sırasıyla belirtilen işlemler uygulandı.
1. Bir temiz tüp içerisinde toplanan DNA çözeltilerinin üzerine 2 katı kadar soğuk saf etanol eklendi ve -20°C’de bir gece bekletildi.
2. Bir gece bekletilen DNA çözeltileri 20 dakika 11.000 g’de santrifüjlendi ve süpernatant atıldı.
3. Pellete soğuk %70’lik etanol eklendi ve dikkatlice karıştırıldı. Çözelti 15 dakika 11.000g’de santifüjlendi ve süpernatant atıldı.
4. Pellet kurutuldu ve 50 µL saf suda içerisinde çözüldü.DNA çözeltisi buzdolabında - 20°C’de saklandı.
24