Farklı Yöntemlerle Pamuk Yağından DNA İzolasyonu Ve Kontrolü

Bitki kökeninin belirlenmesi veya yağda yapılan tağşişleri belirleyebilmek amacıyla kullanılan serbest asitliğin karakterize edilmesi, peroksit miktar tayini ve yağ asitlerinin belirlenmesi gibi fiziksel ve kimyasal işlemlerin yanı sıra DNA temelli teknolojiler günümüzde tercih edilmektedir. Çevresel büyüme koşullarındaki farklılık nedeniyle yaşanabilecek olumsuzluklardan kaçınmak ve tağşişi tespit etmek amacıyla bitkisel yağlara uygulanan ilk işlem basamağı DNA izolasyonudur. Bu tür örneklerde DNA izolasyon yöntemlerinin geliştirilmesi ve daha sonra uygulanacak tekniklere saf, kaliteli ve uygun miktarlarda DNA sağlanması amacıyla literatürde çeşitli çalışmalar bulunmaktadır. Bu çalışmalar genellikle zeytinyağını temel alan çalışmalardır. Hammaddenin ve ondan elde edilen ürünün kaynağını belirlemek, ekstra saf yağ üretmek ve kullanmak gıdalarda kalite kontrollerinin parametrelerinin en önemli etkenlerinden olması nedeniyle zeytinyağından DNA izolasyonuna yönelik birçok çalışma bulunmaktadır. Bu çalışmaların bir kısmı Çizelge 5.1’de özetlenmiştir.

44

Kaynak Yağ örnekleri DNA izolasyon yöntemi Elde edilen DNA konsantrasyonu Muzzalupo ve Perri, 2002 İtalya’da 1999 ve 2000 yılında toplanmış iki Olea europaea çeşidinin yağı; Carolea ve Cassanese

Modifiye CTAB izolasyon yöntemi (Doyle ve Doyle’nin 1990 yılındaki çalışmasından) 5 ng/µL Busconi ve ark., 2003 İtalya’da 1999 yılında toplanmış dört Olea europaea çeşidinin yağı;Casaliva, Moraiolo, Leccino veTaggiasca

Modifiye CTAB izolasyon yöntemi (Murray ve Thompson’ın 1980 yılındaki çalışmasından) 5–10 ng/µL Breton ve ark., 2004 Fransa, İtalya, İspanya ve Portekiz’den zeytinyağları

Promega Wizard Manyetik DNA saflaştırma kiti

Sigma Silika DNA izolasyon kiti Biorad Hydroxyapatite biogel

Miktar belirlenememiştir Testolin ve Lain, 2005 Rende Zeytin Yetiştiriciliği Deneysel Enstitüsü, İtalya’dan alınan süzülmüş ve süzülmemiş sızma zeytinyağı örnekleri

Promega Wizard Manyetik DNA saflaştırma kiti

Qiagen QIAamp dışkıdan DNA izolasyon mini kiti

Qiagen Bitki mini DNA izolasyon kiti

LB Link-Biotech ExtMan 50- 100 DNA kiti

CTAB izolasyon yöntemi (Doyle ve Doyle’nin 1990 yılındaki çalışmasından) 2.8 ± 2.2 ng/µL 5.4 ± 0.9ng/µL 8.7±2.5ng/µL 7.2 ± 1.9ng/µL 5.4 ± 2.9ng/µL Consolandi ve ark., 2008 İtayla, Farnsa, Protekiz ve İspanya’dan toplam sekiz zeytin çeşidinden elde edilen yağlar

Angiolillo ve arkadaşlarının 1999 yılındaki çalışmasından 10–15 ng/µL Ben-Ayed ve ark., 2009 Tunus’un iki zeytin çeşidinden üretilen yağlar; Chemlali ve Chetoui Wizard Kit CTAB (Busconi ve arkadaşlarının 2003 yılındaki çalışmasından)

Qiagen QIAamp dışkıdan DNA izolasyon mini kiti

5–10 ng/µL Raieta ve ark., 2015 İtalya’dan dört O. europeaea L. çeşidi; Ortice, Ortolana, Racioppella ve Ravé CTAB–hekzan–kloroform metodu (Giménez ve ark., 2010 çalışmasından)

0,2–0,6 ng/µL yağ

45

Elde edilen DNA konsantrasyonlarından da anlaşıldığı gibi bu izolasyon yöntemlerinde çeşitli problemler bulunmaktadır. Elde edilen DNA’nın parçalanması, düşük konsantrasyonda DNA eldesi, safsızlıkların bulunması ve bu DNA’larla yapılan ileri çalışmalarda tekrar edilebilirlik problemleri yağlardan DNA izolasyonunda sıklıkla karşılaşılan problemler olarak belirtilmektedir (Agrimonti ve ark., 2011). Yöntem esnasında oluşan problemlere ek olarak zeytinyağı üretim prosesi ve saklama süresinin de DNA elde edilmesine etki ettiği belirlenmiştir. Cresti ve ark. (1996) yaptığı çalışmada soğuk pres ile üretilen yağlardan daha fazla DNA elde edildiği belirtilmiş, Muzzalupo ve Perri (2002) ’nin çalışmasında ise filtrasyon işleminin daha düşük konsantrasyonda DNA elde edilmesine ve nükleazlar tarafından parçalanmasına neden olduğu bulunmuştur.Parfundo ve ark. (2010) çalışmasında ise, 20°C’de karanlıkta, küçük şişeler içinde muhafaza edilen yağların üretiminden bir ay içerisinde DNA izolasyon işleminde daha yüksek verimde DNA elde edildiği dolayısıyla DNA izolasyonu için taze yağların kullanılması gerektiği sonucu bulunmuştur.

Elde edilen DNA miktarının az olmasının ilerleyen basamaklarda kullanılacak olan amplifikasyon metotlarına da olumsuz yönde etki ettiği belirlenmiştir. Düşük konsantrasyonda olması, izolasyon metotlarına bağlı olarak içerisinde fenolik moleküllerin ve polisakkaritlerin bulunması polimeraz zincir reaksiyonunun (PZR) gerçekleşmemesine neden olmaktadır (Testolin ve Lain, 2005; Raieta ve ark., 2015). Pamuktan DNA izolasyon yöntemlerine bakıldığında, pamuk tohumundan izolasyon yöntemleri literatürde sıklıkla çalışılmıştır. Aydin ve ark. (2018) çalışmasında CTAB temelli DNA izolasyon yöntemi kullanılmış ve pamuk tohumlarından ortalama 11.16 μg/tohum DNA elde edilmiştir. Yine CTAB temelli yapılan başka bir izolasyon çalışmasında ise 1.2 μg/mg tohum DNA elde edilmiştir (Ali ve ark., 2019). Genetiği Değiştirilmiş Organizma analizleri için Avrupa Komisyonuna bağlı Ortak Araştırma Merkezi (Joint Research Center) tarafından yayınlanan standart DNA izolasyon metotlarında ise µL DNA çözeltisi başına en düşük 286 ng DNA izole edilmiştir (CRLVL13/04XP, 2007; CRLVL-14/05XP, 2006; CRLVL15/04XP, 2008).

Yukarıda da belirtildiği gibi literatürde pamuk tohumdan DNA izolasyon yöntemleri olmasına rağmen pamuk yağıyla yalnızcabir çalışmaya rastlanmıştır. Huang ve ark. 2010’da yayınladığı çalışmada soya fasulyesi, mısır, kolza ve pamuk tohumundan elde

46

edilen yağ örneklerinden hızlı protein sızı kromatografisi (FPLC) anyon değişim kromatografisi ile DNA izolasyonu yapılmış ve elde edilen DNA’ların PCR için uygun olduğu belirtilmiştir (Huang ve ark., 2010). Ayrıca bu yöntemin CTAB yöntemi ve ticari kit ile karşılaştırıldığında daha kısa sürede daha etkin bir yöntem olduğu sonucuna varılmıştır.

Bu çalışma kapsamında daha önce literatürde zeytinyağı için belirlenen üç CTAB temelli DNA izolasyon yöntemi ve gıdalardan DNA izolasyonu için geliştirilen genel bir DNA izolasyon kiti kullanılarak pamukyağı örneklerinden DNA izolasyonu gerçekleştirildi ve elde edilen DNA’lara ait konsantrasyon ve saflık parametreleri spektrofotometre ile kontrol edildi.

CTAB temelli ilk yöntemde CTAB, hekzan ve kloroform içeren çözeltilerle DNA izolasyonu gereçkleştirildi. CTAB iyonik bir deterjan olarak hücre membranlarını parçalamak amacıyla kullanıldı. Literatürde bitki genomik DNA eldesi için kullanılan yöntemlerin sorunları olarak polisakkritlerin etkin bir şekilde uzaklaştırılamaması durumundan sıklıkla bahsedilmektedir (Agrimonti ve ark., 2011). Çalışmada hekzanın kullanım amacı yüksek miktarda ve saflıkta DNA elde edilmesine ve izole edilen DNA’nın PZR ile amplifikasyonuna engel olan polsakkaritlerin etkin olarak uzaklaştırılmasıydı.

Pamuk yağlarına uygulanan bu ilk protokol ile elde edilen DNA’ların konsantrasyonları Çizelge 4-1 ve Çizelge 4-2’de verildi. Özetle; başlangıç pamuk yağı hacmi 300 µL olan örnekler için en yüksek DNA konsantrasyonu 8 numaralı örnekte (8-3) yaklaşık 58 ng/µL elde edilirken, en düşük DNA konsantrasyonu 6 numaralı örnekte (6-3) yaklaşık 6 ng/µL elde edildi. Örnek hacmi 500 µL’ye çıkarıldığında en yüksek DNA konsantrasyonu 8 numaralı örnekte (8-3) yaklaşık 63 ng/µL elde edilirken, en düşük DNA konsantrasyonu 6 numaralı örnekte (6-1) yaklaşık 6 ng/µL elde edildi. Çizelge 5- 1’de belirtilen zeytin yağına ait literatür çalışmalarında elde edilen DNA’lar genellikle 5-10 ng/µL iken, bu çalışmada birinci protokolle çoğunlukla bu değerlerden yüksek DNA miktarları elde edildi.Pamuk yağının 300 µL’den 500 µL’ye çıkarılmasıyla daha yüksek konsantrasyonda DNA elde edileceği düşünüldü, fakat, DNA miktarındaki artış her örnekte görülmedi. Örneğin; 8 numaralı pamuk yağının beşinci örneğinde başlangıç yağın 300 µL’den 500 µL’ye çıkarılmasıyla DNA miktarında 24,93 ng/µL’den 35,45

47

ng/µL’ye artış görülürken, 6 numaralı pamuk yağının yine beşinci örneğinde başlangıç yağın 300 µL’den 500 µL’ye çıkarılmasıyla DNA miktarında 19,87 ng/µL’den 7,95 ng/µL’ye azalma görüldü.

Saflık değerlerine bakıldığında; 300 µL başlangıç pamuk yağları için 1,29 ile 2,22 değerleri arasındayken, 500 µL yağlar için 1,18 ile 1,86 değerleri arasında hesaplandı. 260 nm’deki absorbans değerinin 280 nm’deki absorbans değerine oranı literatürde kabul gören 1,7 ile 2,1 arasındaki değerler arasında olan yağ örnekleri 300 µL için 4- 3,6-1,6-4, 6-5, 7-3, 8-2 iken, 500 µL için 6-1, 6-3, 8-1 örnekleridir.Bu değerlerle CTAB-hekzan-klorofom yöntemiyle izolasyon işlemi sonrası örneklerden yeterinde proteinin uzaklaştırılamadığı sonucuna varıldı. Ayrıca, literatürde 260 nm’deki absorbans değerinin 230 nm’deki absorbans değerine oranı fenol, tuz ve karbonhidrat kontaminasyonunu hakkında bilgi verir ve genellikle saf DNA için 2,0 ile 2,2 arasında olması beklenir. Bu çalışmada, 260/230 oranı 2,0’dan çok düşük bulundu ve bu izolasyon yönteminde yeterinde fenolik bileşiklerden ve sakkaritlerden kurtulanamadığını gösterdi.

Bu yöntem daha önce Raieta ve ark. (2015) tarafındanzeytin yağından DNA izolasyonu için kullanıldı. Rapor edilen sonuçlara göre bu yöntemin hem çalışmada zeytinden preslenerek elde edilen yağda, hem de ticari olarak temin edilen zeytin yağlarında yüksek miktarda ve kalitede DNA elde edilmesine neden olduğu ve ayrıca zeytin yağlarının teneke, cam ya da plastik şişelerde depolanmasının sonucu etkilemediği belirtildi. Daha önce literatürde zeytin yağlarının üretiminden hemen sonra DNA izolasyonun başarılı olduğu hatta maksimum 1 aylık zeytin yağı ürünlerinden DNA izole edilebildiği bildirildi (Pafundo ve ark., 2010; Costa ve ark., 2012). Fakat Raitera ve ark. çalışmasında CTAB-hekzan-klorofom yöntemiyle DNA’ya zarar vermeden 1 yıllık zeytin yağı ürünlerinden dahi DNA izole edildiği belirtildi. Bu tez çalışması sonucuna bakıldığında ise, sekiz farklı pamuk yağı örneğinden bu yöntemle yapılan DNA izolasyonu sonucu spektral olarak DNA elde edildiği görüldü. Spektral olarak DNA varlığının gösterterilmiş olsa da, izole edilen DNA çözeltilerinin içerisinde özellikle polisakkarit kontaminantının bulunması ilerleyen basamakta PZR’de amplifikasyonun engellenmesine neden olacağı düşünüldü.

48

İkinci DNA izolasyon yöntemi olarak CTAB-merkaptoetanol yöntemi şeçildi. Bu yöntem yine literatürde zeytin yağından DNA izolasyonu için kullanıldığı rapor edilmiş Busconi ve ark. (2003)’nın çalışmasından alındı. Yöntemde yüksek konsantrasyonda ve kalitede DNA elde etmek amacıyla yüksek konsantrasyonda CTAB (%10’luk), iki kere dondur-çöz işlemi (sıvı nitrojen-65°C) ve kloroform:isoamil alkol yerine kloroform:oktanol kullanıldı. Beta merkaptoetanolün çalışmada kullanım amacı kuvvetli bir indirgeyici olarak polifenol ve tanninlerin bitki lizatından uzaklaştırımasını sağlamaktı.Bu yöntem ile pamuk yağından elde edilen DNA’ların konsantrasyonlarına bakıldığında; en yüksek ve en düşük DNA konsantrasyonu sırasıyla yaklaşık 48 ng/µL ve 3 ng/µL bulundu. Bu miktarları daha önce yayınlanan çalışma ile karşılaştırdığımızda, Busconi ve ark. 50-100 mL yağ örneğinden yaklaşık 5 ila 10 ng/µL arasında DNA elde ederken, bizim çalışmada başlangıç pamuk yağı 3,5 mL olan örneklerden çoğunlukla daha yüksek konsantrasyonda DNA elde edildi (Çizelge 4-3). Bunun sonucunda yüksek hacimlerde örnekle izolasyona başlanmanın DNA verimini artırmadığı aksine daha az miktarlarla başlandığında daha yüksek DNA konsantrasyonlarının elde edildiği bulundu.

Yüksek konsantrasyonda DNA elde edilmesine karşın DNA’ların saflık değerleri olması gereken değerden oldukça yüksek olan örnekler elde edildi. Literatürde kabul gören 1,7 ile 2,1 arasındaki saflık değerlerine sahip yağ örnekleri 1-2, 2-4, 5-1, 5-2,5-3, 5-4, 6-4 ve 8-4örnekleri olarak belirlenirken, diğer örnekler çoğunlukla 2,1değerinden yüksek değerlere sahipti. Bu sonucun nedeninin yöntemin RNA kontaminasyonuna yeterince engel olmadığı olarak düşünüldü.

Çalışmada CTAB temelli son yöntem ise CTAB yöntemiydi. Bu yöntem Doyle ve Doyle’nin 1990 yılındaki çalışmasından birkaç modifikasyon yapılarak alındı. Orijinal yöntemde indirgeyici olarak kullanılan beta merkaptoetanol bu çalışmada kullanılmadı. Ayrıca, CTAB-hekzan-kloroform yönteminde olduğu gibi bağlangıç pamuk yağı miktarı hem 300µL hem de 500µL olarak iki farklı set DNA izolasyonu yapıldı.

Sekiz farklı pamuk yağı örneğinden bu yöntemle izole edilen DNA’ların konsantrasyon değerleri 300 µL başlangıç pamuk yağı örnekleri için Çizelge 4-4’de, 500 µL başlangıç pamuk yağı örnekleri için ise Çizelge 4-5’de belirtildi. Başlangıç pamuk yağı hacmi 300

49

µL olan örnekler için en yüksek ve en düşük DNA konsantrasyonları sırasıyla yaklaşık 143 ng/µL ve 3 ng/µL olarak elde edildi. Örnek hacmi 500 µL’ye çıkarıldığında ise en yüksek DNA konsantrasyonu yaklaşık 42 ng/µL elde edilirken, en düşük DNA konsantrasyonu yaklaşık 4 ng/µL elde edildi. Genel olarak bakıldığında 5 ng/µL’den düşük konsantrasyonda sadece beş örnek elde edildi. Bu yöntem çeşitli modifikasyonlarla daha önce zeytin yağından DNA izolasyonu için çalışıldı. Örneğin; Muzzalupo ve Perri (2002) zeytin yağlarından 5 ng/µL değerlerinde DNA elde ederken, Testolin ve Lain (2005) 5.4ng/µL konsantrasyonunda DNA elde etti. Bu tez çalışmasının sonuçlarına bakıldığında çoğunlukla yüksek konsantrasyonda DNA elde ediliği sonucuna varıldı.

Saflık değerlerine bakıldığında ise çalışmada kullanılan diğer manuel protokollere göre daha fazla sayıda yağ örneğinden literatürde belirtilen değerler arasında saflık değerine sahip DNA izole edildidiği görüldü. Kabul edilebilir saflıkta yağ örnekleri 300 µL için 1-3, 3-1, 4-3, 5-2, 6-3, 6-5, 7-5 iken, 500 µL için 1-4, 2-2, 4-1, 5-3, 5-5, 6-3, 6-4, 6-5, 7- 2, 7-3, 7-4, 8-5 örnekleri olarak belirlendi. Dolayısıyla, bu çalışmada kullanılan CTAB temelli manuel yöntemler içerisinde verimli ve saf DNA eldesinin CTAB yöntemiyle olduğu sonucuna varıldı.

Çalışmada kullanılan son yöntem ise ticari olarak temin edilen ve çeşitli gıdalarda kullanılan innuPrep Food DNA Kit (Analytikjena, Almanya) yöntemiydi. Kit yönteminin kullanılmasındaki amaç, manuel yöntemlerle izole edilen DNA’larda karşılaşılabilecek problemlere karşı pozitif kontrol olarak kullanılabilecek DNA’ların elde edilmesiydi. İzole edilen DNA’lara ait sonuçlar Çizelge 4-6’da belirtildi.Beklenilenin aksine pamuk yağlarından diğer üç manuel yönteme göre daha az konsantrasyonda DNA elde edildi. En yüksek DNA 1-3 numaralı örnekten yaklaşık 12,3 ng/µL elde edilirken, en düşük DNA yaklaşık 0,6 ng/µL olarak 3-1 numaralı örnekten izole edildi. Ayrıca, kabul edilebilir saflık değerleri ise 1-3, 1-4, 1-5, 3-1, 3-4, 3-5 numaralı yağ örnekleri olarak belirlendi. Farklı kitlerle zeytin yağından DNA izolasyon çalışmalarına bakıldığında, Testolin ve Lain(2005) tarafından Promega Wizard Manyetik DNA saflaştırma kiti ile 2.8ng/µL, Qiagen QIAamp dışkıdan DNA izolasyon mini kiti ile 5.4 ng/µL, Qiagen Bitki mini DNA izolasyon kiti ile 8.7ng/µL ve LB Link- Biotech ExtMan 50-100 DNA kiti ile 7.2 ng/µL DNA elde edildiği rapor edildi. Yine başka bir çalışmada ise Qiagen QIAamp dışkıdan DNA izolasyon mini kiti ile 5–10

50

ng/µL DNA izole edildiği belirtildi (Ben-Ayed ve ark., 2009). Bu çalışmada literatürde belirtilen değerlere benzer değerler elde ediliği görüldü.

5.2 Pamuk Yağında DNA İzolasyon Yöntemlerinin Etkinliğinin Değerlendirilmesi

Çalışma kapsamında kullanılan dört izolasyon yöntemini karşılaştırılması yapıldığında,DNA verimi ve kalitesi açısından dört yönteminde birbirinden farklı olduğu görüldü(Şekil 4-1 ve Çizelge 4-7). İzolayon yönteminin tekrar edilebilirliği açısından değerlendirildğinde kit yönteminin diğerlerine göre tekrar edilebilirliği daha yüksek bulundu. Şekil 4-1’deki her yönteme ait bar grafikleri incelendiğinde hata barları en düşük olan yöntem kit yöntemiydi. Ayrıca, Çizelge 4-7’de gösterilen konsantrasyon değerleri birbirine en yakın sonuçlar kit yöntemiyle elde edildi. CTAB- hekzan-kloroform yönteminde elde edilen DNA ‘ların konsantrasyonları %8.6 ila % 66 arasında varyans gösterirken, CTAB-merkaptoetanol yönteminile izole edilen DNA’ların sonuçları %24 ila %89 arasında varyans gösterdi. Kit yönteminin sonuçları ise en fazla %2.1’lik varyans gösterdi. Bu nedenlerden dolayı, hem tekrar edilebilirlik hem de örnekler arasındaki varyans açısından kit yönteminin daha iyi sonucuna varıldı.

5.3 Farklı Yöntemlerle İzole Edilen DNA’ların Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizlerine Etkinliğinin Değerlendirilmesi

İzolasyon sonucu elde edilen DNA çözeltisinde kalan fenol, tuz, protein, RNA ya da polisakkarit varlıkları amplifikasyon reaksiyonunu etkilediğinden çalışma kapsamında saflık değerlerinin spektral değerlendirilmesi PZR’da sıkıntıları yaşanacağının ilk göstergesi olarak değerlendirildi ve bununla ilgili tartışma “5.1 Farklı Yöntemlerle Pamuk Yağından DNA İzolasyonu Ve Kontrolü” başlığı altında verildi.Dört izolasyon yönteminin sonucu olarak pamuk yağından istenilen saflıkta DNA izolasyonu elde edilememesine rağmen bu DNA’ların amplifikasyon durumları klasik PCR yöntemiyle kontrol edildi.

Amplifikasyon için seçilen primerler pamuğa özgü bir gen olan acyl taşıyıcı protein 1 kodlayan gen (acp 1)’di.Bu gen bölgesi daha önce GDO analizlerinde referans gen olarak Avrupa Birliği Referans Laboratuvarı (EURL) tarafından valide edilen bir

51

bölgedir. Şekil 5-1’de bu gen bölgesine tasarlanan primerlerin bağlanma bölgeleri gösterildiği şekil bulunmaktadır.

Şekil 5- 1Pamuk (Gossypium hirsutum)’ın 15. kromozomunda bulunan acp 1 gen bölgesine tasarlanan primerlerin bağlanma bölgeleri (EURL, 2016).

Kullanılan primerler ile 76 baz uzunluğunda bir bölgenin amplifikasyonu beklenirken dört yöntem sonucunda elde edilen DNA’ların çoğaltılamadı görüldü (Şekil 4-2). İzole edilen DNA’ların parçalanmış olması, çözeltide fenol ve polisakkarit kontaminasyonlarının varlığı ya da yeterli DNA olmaması durumu nedeniyle amplifikasyonun görülememesi üzerine izole edilen DNA’ların replikaları birleştirilerek etanol temizleme işlemi yapıldı. Etanol ile temizleme işleminin kullanılmasındaki amaç ortamda DNA dışında bulunan safsızlıkların ortamdan olabildiğince uzaklaştırılması ve böylece 260/280 ve 260/230 değerini yükseltmekti. Etanol ile çöktürülen DNA’ların konsantrasyonları tekrar ölçüldüğünde, DNA miktarında kayıplar olmasına karşın daha saf DNA’ların elde edildiği görüldü (Çizelge 4-8). CTAB yöntemiyle izole edilen DNA’ların hem konsantrasyon değerlerinde hem de saflık değerlerindeki artışın gözlenmesine ek olarak agaroz jel elektroforez ile temizlenmiş genomik DNA’ların görüntülenmesi yapıldı. Genomik DNA’ların saf ve kırılmadan elde edildiği görüldükten sonra acp-1 gen bölgesine özgü primerler ile amplifikasyon reaksiyonu gerçekleştirildi.