3.5.1 DESENHO DOS PRIMERS
Os primers para os treze genes regulados por SKN-1 foram desenhados utilizando-se o software primer3 (versão 0.4.0) (http://frodo.wi.mit.edu/primer3), inserindo-se a sequência a ser flanqueada de cada gene e atentando às especificações de temperatura de anelamento (~60ºC) e conteúdo GC máximo (50%). A sequência de primers para os genes de referência endógena foram obtidas de (Hoogewijs e cols., 2008). O tamanho especificado para cada primer era de no mínimo 100 e no máximo 150 pares de base, o apropriado para a técnica de qPCR empregada nos ensaios. Os primers estão dispostos na Tabela 3.
29 3.5.2 EXTRAÇÃO DE RNA
A extração de RNA total foi feita conforme o método do Trizol descrito por Chomczynski e Sacchi (2006), adaptado para as condições de trabalho com C. elegans. Placas contendo de 100 a 5000 animais foram lavadas utilizando água tratada com dietilpirocarbonato (DEPC)(Sigma – Aldrich, São Paulo, Brasil), substância que inativa as RNAses presentes. Os animais suspensos no meio líquido foram depositados em microtubos estéreis, previamente autoclavados por 40 minutos. Os animais foram lavados três vezes a fim de remover o excesso de bactérias. Após tal procedimento, o excesso de água DEPC foi retirado e um volume de 1,5mL de BRAzol (LGC Biotecnologia, São Paulo, Brasil) foi adicionado aos microtubos. O BRAzol é um reagente que lisa a cutícula do C. elegans e mantém a integridade dos seus ácidos nucleicos, para posterior precipitação. Como o C. elegans possui uma cutícula resistente, após a adição do BRAzol, os microtubos foram submetidos à homogeneização em vortex por 30 segundos, a fim de auxiliar no rompimento dessa cutícula. Os microtubos foram então deixados à temperatura ambiente por 10 minutos, para que se realizasse a extração. Em seguida, os microtubos foram centrifugados por 20 minutos a 16168 G, a 4º C. O sobrenadante foi transferido para novos microtubos livres de RNAses, aos quais foram adicionados 200 μL de clorofórmio, seguido de homogeneização por 15 segundos em vortex.Após a homogeneização, os microtubos foram deixados por 3 minutos à temperatura ambiente e posteriormente foram submetidos à centrifugação a 16168 g a 4º C por 20 minutos. O sobrenadante foi transferido para novos microtubos livres de RNAses. Ao sobrenadante foi adicionado um volume igual de isopropanol e os microtubos foram deixados à temperatura ambiente por 10 minutos para precipitação do RNA.
Os microtubos foram então centrifugados por 10 minutos a 13362 G e a 4º C. O pellet foi lavado com 350 μL de Etanol 70% em água DEPC (Sigma – Aldrich, São Paulo, Brasil). Os microtubos foram então centrifugados a 16168 G por 5 minutos a uma temperatura de 4º C, e o sobrenadante de Etanol 70% foi removido.
30 Tabela 3: Sequência de Primers utilizados na reação de qPCR, obtidos através do software Primer3
Gene Sentido Sequência flanqueadora Temperatura de
anelamento (oC) Conteúdo GC(%) Tamanho do fragmento gerado (pb) *act-1 F GCTGGACGTGATCTTACTGATTACC 64,6 48 114 R GTAGCAGAGCTTCTCCTTGATGTC 64,6 50 *ama-1 F CCTACGATGTATCGAGGCAAA 60,6 47,6 139 R CCTCCCTCCGGTGTAATAATG 62,6 52,4 atp-5 F ACGTCTTCCGTGAACTGGTC 62,4 55 143 R GCAAAGTCGATCTTGGGAAG 60,4 50 *cdc-42 F CTGCTGGACAGGAAGATTACG 62,6 52,4 111 R CTCGGACATTCTCGAATGAAG 60,6 47,6 fah-1 F CTCGGATTTCCCAATTCAAA 56,3 40 117 R TTGGCAATTTCTGCCAAGTT 56,3 40 *gpd-2 F CTCCATCGACTACATGGTCTACTTG 64,6 48 151 R AGCTGGGTCTCTTGAGTTGTAGAC 64,6 50 nekl-2 F GACGTGGTGCTTTTGGAGTT 60,4 50 106 R TCTTTTTCAGTCATTCCGTGAG 58,9 40,9 pas-4 F TCCCCTGATGGACACTTGTT 60,4 60,4 147 R GATTGTGCGGTCATCTTGAA 58,4 58,4 pas-6 F AAGAGTGAAACCCACGCTGT 60,4 50 117 R GAGACCAGCGATGGAAACTC 62,4 55 pbs-2 F CCCATTCACAGCTCAAGGAT 60,4 50 148 R GTTTCCTGAGGCGTTGTCAC 62,4 55 pbs-3 F TGAGCTACACTGGTGGAACC 62,4 55 100 R GTTGCAATTGTTGTCATCTGC 58,7 42,9 pbs-4 F GGGAATTTCCACCGAAAACT 58,4 45 134 R CTCCGATGCACATCATTGTC 60,4 50 *pmp-3 F GTTCCCGTGTTCATCACTCAT 62,6 47,6 115 R ACACCGTCGAGAAGCTGTAGA 67,5 52,4 rpt-5 F GCTGATTGAAGCTGTTGTGC 60,4 50 149 R TTGATTTAGTTTGGGCAGCA 56,3 40 *tba-1 F GTACACTCCACTGATCTCTGCTGACAAG 67,5 50 194 R CTCTGTACAAGAGGCAAACAGCCATG 66,2 50 vha-12 F CCGGACAGGTTCTTGAAATC 60,4 50 136 R AGCATGTCTTCGGAAACTGG 60,4 50 vha-13 F TCATTTCCCAATCTCTCTCCA 58,7 42,9 133 R GTGACACCTTCGACCTCCAT 62,4 55 vha-6 F GGAACAGAATGCGTACACGA 60,4 50 138 R GCCGGAATATGCTCATCGTA 60,4 50 vha-8 F AGCCGAGGAAGAATTCAACA 58,4 45 142 R CGTCCAGCGTTGAGAGAGT 62,4 55
31 Os microtubos foram deixados secando à temperatura ambiente para remover qualquer excesso de Etanol e um volume de 24 μL de água DEPC (Sigma – Aldrich, São Paulo, Brasil) foi adicionado para a ressuspensão dos pellets. Os microtubos foram submetidos a banho-maria de 60º C por 10 minutos, para a dissolução do RNA. As amostras foram armazenadas a -80º C.
As amostras de RNA extraído tiveram sua concentração e densidade óptica medidas pelo uso da máquina Nanovue (GE Healthcare, São Paulo, Brasil).
3.5.3 ELETROFORESE DE RNA EM GEL DE AGAROSE
Para verificar a integridade do RNA extraído, amostras aleatórias de RNA foram selecionadas e submetidas a gel de agarose em condições desnaturantes. As amostras foram preparadas com cerca de 3μg de RNA total adicionado de 2μL de tampão de coloração de formaldeído 10X (50% glicerol diluído em água DEPC; 10mM EDTA pH 8,0; 0,25% m/v de azul de bromofenol, 0,25% m/v de xileno cianol) e 2 μL de brometo de etídio (200μg/mL). Tais amostras foram então aquecidas a 75ºC durante dez minutos, para que ocorresse a desnaturação do RNA, e em seguida, foram aplicadas em gel de agarose 1% (0,50g de agarose e 50 mL de TBE 1X), sendo submetidas à eletroforese por aproximadamente duas horas e meia a 80V.
Toda a vidraria utilizada nesse processo passou previamente por uma lavagem e posterior aquecimento a 160ºC por três horas, e a cuba e demais materiais sofreram tratamento com peróxido de hidrogênio três volumes para remoção de quaisquer RNAses que pudessem degradar as amostras carregadas.
O gel foi fotografado em um transiluminador UV de 302 nM, T26M, (BioAgency, São Paulo, Brasil), no qual foi possível verificar o padrão de bandas de RNA comparado com um peso molecular de DNA.
3.5.4 SÍNTESE DO DNA COMPLEMENTAR (CDNA)
Os cDNAs foram obtidos a partir do kit High-Capacityc DNA Reverse Transcription (AppliedBiosystems, Califórnia, Estados Unidos). Para a síntese de
32 cDNA foram adicionados 1500 ng de RNA total, 2,0µl de tampão, 0,8µl de dNTP, 2,0µl de random primers e 1,0µl de transcriptase reversa. Esta solução foi colocada a 25° por 10 minutos, seguida de 37° por 120 minutos. Este cDNA foi armazenado em freezer a –20° até a realização dos estudos de PCR.
3.5.5 PCR EM TEMPO REAL (qPCR)
Nas reações de qPCR realizadas no presente trabalho, foi empregada a técnica de RT-PCR quantitativo (qRT-PCR), usando o sistema de detecção de sequência 7500 Real Time PCR System (AppliedBiosystems, Califórnia, Estados unidos) e o kit SYBR® Green PCR Master Mix (AppliedBiosystems, Califórnia, Estados unidos). A amplificação por PCR foi realizada em placas de polipropileno para 96 reações (Axygen Scientific, Califórnia, Estados Unidos), cobertas com tampas para microplacas (Axygen Scientific, Califórnia, Estados Unidos). Cada reação foi feita em triplicata, utilizando-se 2μL de cDNA, 4,9μL de H2O MiliQ, 7,5μL de SYBR® Green (Applied Biosystems, Califórnia, Estados unidos), e 0,6μL do primer do gene-alvo, para um volume total de reação de 15μL. As amostras foram mantidas, na etapa inicial, a 95ºC por 10 minutos (desnaturação inicial); na etapa seguinte, 40 ciclos, a 95ºC por 1s (desnaturação) e 60ºC por 1 minuto (anelamento e extensão). O protocolo de dissociação foi realizado alternando a temperatura entre 95ºC por 15 segundos; 60ºC por 1 minuto; 95ºC por 30 segundos e 60ºC por 15 segundos.
Para cada amostra, obtivemos uma curva de amplificação e uma curva de dissociação, que é específica para cada gene. A representação gráfica foi realizada segundo os valores de threshold (valores Ct), deduzidos a partir do valor Ct obtido para os transcritos, usando o método 2-∆∆Ct, com o nível dos genes de referência endógena com o controle interno.
3.5.6 PADRONIZAÇÃO DA qPCR
As curvas de calibração foram elaboradas em triplicata, a partir de diluições seriadas de cDNA (500ng, 50ng, 5ng, 0,5ng e 0,05ng), derivadas dos RNAs extraídos
33 de animais N2.Foram utilizados quatro pontos para a construção das curvas-padrão, que obtiveram uma eficiência superior a 95%. Somente foram consideradas curvas-padrão satisfatórias para referência aquelas com slope entre 3,1 e 3,9 (idealmente 3,3).
3.5.7 ESCOLHA DO GENE DE REFERÊNCIA ENDÓGENA
O protocolo para a realização da qPCR das amostras dos genes de referência endógena foi o mesmo descrito em 3.5.5. Usamos como candidatos os genes act-1, ama-1, cdc-42, gpd-2, pmp-3 e tba-1 (Hoogewijs e cols., 2008). O CT de expressão de cada gene candidato foi comparado entre as linhagens N2 e skn-1(zu135). O gene ideal para a referência endógena é o que não apresenta variações nos seus níveis de expressão entre as linhagens testadas.
3.5.8 ANÁLISE DOS NÍVEIS DE EXPRESSÃO POR MEIO DO MÉTODO DO CT COMPARATIVO (2-∆∆Ct)
O protocolo para a realização da qPCR das amostras dos genes-alvo foi o mesmo descrito em 3.5.5.
O CT é o primeiro ciclo de amplificação no qual o a fluorescência é detectada acima da linha basal. O cálculo do ∆CT é feito ao se subtrair a média dos valores do CT do gene de referência endógena da média do CT de cada gene-alvo no N2 e skn- 1(zu135). O ∆∆CT é obtido ao se subtrair o ∆CT encontrado no N2 do ∆CT encontrado no skn-1(zu135). O valor do ∆∆CT obtido é elevado à potência 2 para determinar a alteração no nível de expressão de cada gene-alvo. As análises foram repetidas três vezes, com diferentes amostras biológicas.