Dados obtidos em nosso laboratório correlacionaram eIF5A com a via secretória em S. cerevisiae. Neste estudo, o gene YPT1, o qual é essencial e atua na fusão das vesículas do retículo endoplasmático (RE) ao complexo de Golgi (Segev 2001), foi identificado como letal sintético com um mutante condicional de eIF5A (tif51A-3). Ainda, foi observado que eIF5A se liga a frações de membrana, porém não atua diretamente no transporte vesicular. Além disso, ficou evidente que a participação de eIF5A nesta via não se da de maneira geral, pois mutantes de eIF5A não apresentaram defeito no processamento de CPY, protease que é translocada exclusivamente pela via pós-traducional da via secretória (Frigieri et al. 2007; Frigieri
et al. 2008).
A via secretória, cuja função é direcionar proteínas para sofrerem modificações pós-traducionais em compartimentos celulares (ex. RE), além do direcionamento de proteínas para o brotamento e consequentemente crescimento polarizado, é dividida em duas vias. Estas, conhecidas como via pós-traducional e via co-traducional, se diferem pela maneira pela qual ocorre a translocação das proteínas. Na via pós-traducional, ou via independente de SRP (Signal Recognnition Particle), ocorre a síntese da cadeia polipeptídica e chaperonas são necessárias para manter o peptídeo desnaturado no citoplasma até que este seja translocado ao lúmen do RE. Isto ocorre por meio do translocon formado por Sec61 e Sec62/63 (Chirico et al. 1988; Caplan et al. 1992). Alternativamente, a translocação de proteínas pode ser realizada por meio da via co-traducional. Nesta, a síntese da cadeia polipeptíca ocorre concomitantemente à translocação, e é mediada pelo complexo SRP, o qual se liga ao peptídeo nascente através de uma sequência sinal e promove a parada da síntese protéica. Após a ligação de SRP ao translocon Sec61, a síntese da cadeia polipeptídica é retomada e ocorre a sua translocação para o lúmem do RE. Em S.
cerevisiae, esta via é dependente do complexo SRP, o qual é formado pelas seguintes
subunidades: Srp21, Srp14, Sec65, Srp54, Srp68 e Srp72. (Mason et al. 2000; Rapoport et al. 1999; Keenan et al. 2001). A Figura 15 apresenta um esquema simplificado dessas duas vias de translocação de proteínas para o RE (Rossi et al. 2014).
Uma vez excluída a participação de eIF5A na via pós-traducional, já que mutantes de eIF5A não apresentam defeitos no processamento de CPY, bem como de outros repórteres testados (Frigieri et al. 2008; Rossi et al. 2014), fez-se necessário testar a correlação entre eIF5A e os fatores que atuam na via co-traducional. Para tanto, foram selecionados mutantes condicionais de SEC62 (sec62-ts), SEC65 (sec65-
1) e SEC61 (sec61-2), os quais atuam, respectivamente, na via pós-traducional, na via
co-traducional ou em ambas (Figura 15). Estes mutantes foram então, da mesma forma que descrito anteriormente, cruzados com o mutante tif51A-1 coberto com
TIF51A em plasmídeo URA3, os diploides foram selecionados, e seguiu-se para a
seleção do haploide de interesse de acordo com o descrito no item 3.2.4. Esses haplóides, cobertos com TIF51A, URA3 foram então transformados com o plasmídeo
TIF51A, LEU, CEN (pSV 146) ou com o plasmídeo vazio (pSV59) e foram
submetidos ao ensaio de plasmid shuffle. Como mostra a Figura 16, foi possível identificar interação genética sintética negativa com o mutante que atua exclusivamente na via co-traducional, sec65-1. Além disso, o mutante sec61-2, o qual apresenta defeito tanto na via co-traducional quanto na via pós-traducional também apresentou interação genética negativa quando combinado com o mutante tif51A-1. Por fim, o mutante sec62-ts, o qual apresenta defeitos exclusivos na via pós- traducional, quando combinado com o alelo mutante tif51A-1 não apresentou nenhuma alteração no crescimento celular. Estes resultados de interação genética apontam para um envolvimento de eIF5A exclusivo na via co-traducional. Estes resultados em conjunto com a supressão do fenótipo de sensibilidade a temperatura do mutante tif51A-1 pelo complexo SRP, os defeitos no processamento de proteínas pela via co-traducional e na ligação entre o peptídeo nascente com o complexo SRP no mutante tif51A-1 deram origem ao artigo intitulado “eIF5A has a function in the cotranslational translocation of proteins into the ER”, publicado na revista Amino Acids (Rossi et al. 2014, Anexo II).
Figura 15. Esquema simplificado da translocação de proteínas para o reticulo endoplasmático. O esquema representa os genes utilizados na análise de
interação genética com o mutante tif51A-1, ilustrando a via dependente de SRP (via co-traducional) e a via independente de SRP (via pós-traducional).
Figura 16. Avaliação da interação genética sintética entre tif51A-1 e os mutantes sec65-1, sec61-2 e sec62-ts, relacionados à via secretória. As linhagens
indicadas, contendo o gene selvagem TIF51A ou o vetor vazio, foram crescidas, diluídas seriadamente e plaqueadas na presença ou ausência de 5-FOA para realização do plasmid shuffle. Em seguida, foram incubadas na temperatura permissiva de crescimento (30°C) por 3 dias.
tif51A-1 30 ⁰ C sec62-ts vector TIF51A sec61-2 vector TIF51A
Sc -Leu -Ura 5-FOA
sec65-1
vector TIF51A
4.3. Rastreamento de novas interações genéticas envolvendo eIF5A
Com o intuito de melhorar o entendimento da função de eIF5A, foi realizada a caracterização das interações genéticas de eIF5A em larga escala, utilizando mutantes deste fator e de sua enzima modificadora Dys1. A utilização de diversos mutantes se deve ao fato que além de eIF5A ter sido relacionada a várias funções celulares no passado, os mutantes utilizados nos rastreamentos apresentam diferenças na severidade e nos defeitos apresentados (Valentini et al. 2002; Dias et al. 2008). Portanto, foram selecionados 4 mutantes do gene que codifica para eIF5A e um mutante do gene DYS1, que codifica uma das enzimas para a modificação pós- traducional essencial de eIF5A. Para eIF5A, foram selecionados os alelos tif51A-1,
tif51A-3, tif51AK56A e tif51AQ22H/L93F. Os alelos tif51A-1 e tif51A-3 foram gerados por mutagênese química em uma busca por genes relacionados ao transporte nucleocitoplasmático, sendo posteriormente identificados como mutantes para eIF5A (Sadler et al. 1989; Valentini et al. 2002). Diferentemente os alelos tif51AK56A e
tif51AQ22H/L93F foram gerados por mutação sítio-dirigida e por PCR mutagênica, respectivamente (Dias et al. 2008). Diferenças fenotípicas foram descritas para estes mutantes, sendo os alelos condicionais tif51A-1 e tif51A-3 os mais sensíveis ao aumento de temperatura e que apresentam diminuição nos níveis de eIF5A total quando na temperatura restritiva de crescimento (Valentini et al. 2002). Por outro lado, os alelos condicionais tif51AK56A e tif51AQ22H/L93F além de serem mais resistente ao aumento de temperatura, não apresentam diminuição nos níveis de eIF5A total quando na temperatura restritiva de crescimento (Dias et al. 2008). No caso do mutante condicional dys1-1, gerado por mutação sítio-dirigida, apresenta diminuição nos níveis de eIF5A hipusinada, sendo então utilizado como um mutante que apresenta defeitos na modificação pós-traducional e, consequentemente, na função de eIF5A (Galvão et al. 2013).
Dessa forma, a identificação das interações genéticas sintéticas com os diversos mutantes pode contribuir para a determinação da função de eIF5A, bem como para o esclarecimento da especificidade apresentada pelos diferentes mutantes.
Para a caracterização das interações genéticas sintéticas de maneira global, foi utilizada a metodologia conhecida como Synthetic Genetic Array (SGA), a qual permite, como apresentado anteriormente, a realização de rastreamento e identificação das interações genéticas sintéticas em larga escala.
Neste trabalho, os rastreamentos iniciais por SGA foram realizados durante o doutorado sanduíche na Universidade de Toronto, sob supervisão da Profa. Dra. Brenda Jean Andrews, e os rastreamentos confirmatórios bem como as análises das interações identificadas foram realizados na Faculdade de Ciências Farmacêuticas - UNESP.
Para tanto, inicialmente, foi necessária a geração das linhagens contendo os alelos selvagem e mutantes, no background genético específico para o rastreamento por meio do SGA.