Orbitrap analizörü

K.H. Kingdon, 1923 yılında merkez elektrodun etrafında belirli bir yörüngede dönerek iyonları yakalayan bir yöntem geliştirmiştir. Fakat, bu düzenek uzun yıllar kütle spektrometresi olarak değil, iyon yakalama cihazı olarak kullanılmıştır. Bu cihazda iyonların yakalanması için manyetik veya dinamik (RF) elektrik alanların yerine elektrostatik alandan yararlanılmıştır. Düzenek, merkezde (içte) ince tel elektrot, dışta merkez ile eş eksenli elektriksel olarak izole edilmiş silindirik elektrot ve iki uçta uçları kapatan iki tane elektrottan oluşmaktadır. İç ve dış elektrotlara uygulanan DC voltajı ile iki elektrot arasında radyal logaritmik bir potansiyel oluşmakta ve iyonlar tel elektrodun etrafında belirli bir yörüngede dönmektedir. Uç elektrotlara uygulanan potansiyel ile de iyonlar eksensel olarak hareket etmekte ve tuzak içerisinde tutulmaktadır. 1981 yılında ise R.D. Knigth, Kingdon tuzağındaki dış elektrodun şeklini değiştirerek radyal logaritmik ifadeye ek olarak eksensel kuadrupol terimini üretmiştir. İç ve dış elektrotlar arasındaki logaritmik potansiyel Kingdon tuzağında olduğu gibi iyonların radyal yönde orbital olarak yakalanmasını sağlarken, kuadrupolar potansiyel ise iyonların z yönünde harmonik salınım hareketi yaparak düzlemsel olarak hapsedilmesini sağlamaktadır. Orbitrap kütle analizörü ise 2000 yılında Alexander Makarov tarafından Knigth tarzı Kingdon tuzağından esinlenilerek tasarlanmış ve 2005 yılında ticari olarak piyasaya sunulmuştur (Hu vd 2005, Westman-Brinkmalm ve Brinkmalm 2009). Günümüzde ise kütle spektrometresi alanında çok önemli bir yere sahiptir. Bu analizörün analitik performansı, cihazın rutin bileşik tanımlamasından karmaşık yapıdaki matrikslerde eser miktarda bileşen analizine kadar geniş uygulama alanında kullanılmasına olanak vermektedir (Makarov ve Scigelova 2010).

Orbitrap, temeli iyon sapması (elektrikli/manyetik sektör), iyon kararlılığı (kuadrupol, kuadrupol iyon tuzağı) veya uçuş süresi (TOF) ölçümlerine dayanan analizörlerden farklı olarak iyon frekansına göre analiz yapan bir kütle analizörüdür (Marshall ve Hendrickson 2008). Frekans, genlikten ve iyon enerjisinden bağımsız olduğu için kütle analizinde iyonlar sadece m/z değerine göre ayrılmaktadır. Orbitrap, bir iyon tuzağı analizörüdür. Kuadrupol iyon tuzağında iyonlar dinamik elektriksel alanda RF ile tuzakta tutulurken, orbitrap analizöründe iyonları tutmak için ne RF ne de mıknatıs kullanılmaktadır. Orbitrap, hareketli iyonları sabit elektriksel alanda (elektrostatik) kuadro-logaritmik potansiyel ile merkez elektrodun etrafında belirli bir

31

yörüngede tutmaktadır (Hu vd 2005, Marshall ve Hendrickson 2008). Orbitrap analizörünün çalışma prensibi, Knigth tarzı Kingdon tuzağı ile aynı olup aralarında elektrot şekilleri açısından şekilsel olarak fark bulunmaktadır. Bu analizör, çan şeklinde bir çift dış elektrot tarafından çevrelenen iğ şeklinde merkez elektrottan oluşmaktadır. İyonlar, merkez elektrot etrafında r yönünde (radyal ve açısal) orbital hareket ederken aynı zamanda z yönünde (eksensel) sürekli olarak salınım yapmaktadır (Şekil 2.8). Ancak elektrotların kendine özgü şekli, radyal ve eksensel iyon hareketlerinin birbirinden bağımsız olmasını sağlamaktadır (Hu vd 2005, Perry vd 2008).

Şekil 2.8. Orbitrap iyon hareket yönleri

İyonların r yönündeki hareketi iyon kütlesinden bağımsız olarak iyonların kinetik enerjisinden ve dış ve iç elektrotlar arasındaki elektriksel alan kuvvetinden (2.1) kaynaklanmaktadır; z yönündeki hareketi ise, r yönündeki hareketinden tamamen bağımsız olup, elektrotlar arasındaki sabit potansiyelde iyonların sadece m/z değerine (2.2) göre gerçekleşmektedir. İyonların radyal ve eksensel hareketi belirli sayıda döngüden sonra ince halka şeklini almaktadır. İlk denklemde; r elektrostatik analizörün yarıçapını, qV iyon kinetik enerjisini ve qE de iyonun elektriksel alanda maruz kaldığı kuvveti ifade etmektedir. İkinci denklemde; m/z iyonun kütle/yük oranını ve k eksensel kuvveti ifade etmektedir. k değeri, elektrotların şekline ve uygulanan potansiyele bağlı olarak belirlenmektedir (Hu vd 2005, Perry vd 2008).

(2.1)

(2.2)

Orbitrap kütle analizörü ile güvenilir kütle ölçümleri yapılarak 1 ppm değerinin altında kütle sapması elde edilebilmektedir. Bu özelliği küçük yapılı moleküllerin analizinde önemli ölçüde yararlı olmaktadır. Yüksek çözünürlükte sinyal gürültüden iyi bir şekilde ayrılacağı için (S/N˃2-3) iyonun tam kütle değeri belirlenebilmektedir. Bir bileşiğin kütlesinin yüksek doğrulukta ölçümü, diğer olasılıkların elenmesini sağlayarak elementel bileşiminin kolayca belirlenmesi açısından önemlidir. Ancak, molekül yapısındaki elementlerin sayısının veya bileşiğin molekül kütlesinin arttığı durumlarda

32

doğru kütle ölçümü onun elementel yapısının belirlenmesinde yeterli olmamaktadır. Bu değere ilaveten, molekül yapısının belirlenmesine izotop piklerin yoğunluğu önemli ölçüde katkı sağlamaktadır. Çözünürlük değerinin yüksek olması kütle doğruluğunun güvenilirliği açısından çok önemlidir. Buna ilaveten, kütle toleransının çok geniş tutulması girişim unsurlarının ilgili bileşiğin pik alanına dahil olmasından dolayı doğru kütle ölçümlerinde hataya ve ayrıca yanlış pozitif sonuçların elde edilmesine; çok dar tutulması da bileşiğin kütle değerinde hatalara ve buna bağlı olarak da yanlış negatif sonuçlara neden olmaktadır (Scigelova ve Makarov 2009).

ESI işlemi ile oluşan iyonlar, atmosfer basıncındaki ortamda iyon transfer kapilerine girmekte ve basıncın gradiyent olarak azaldığı, yüksek vakum altında tutulan iyon optikleri ile yüksek vakum altında bulunan analizöre iletilmektedir (Anonymous 2009a). Gaz fazındaki iyonlar oldukça reaktif ve genelde kısa ömürlü olduklarından dolayı, iyonlar oluştuktan sonra detektöre iletilene kadar yüksek vakum altında olmalıdır. Ayrıca yüksek vakum iyonların birbiriyle çarpışmasını engellemektedir. Bu yüzden; iyon optikleri, analizör ve detektör de vakum altında tutulmalıdır. Kütle spektrometresinin bu kısımlarında yüksek vakum sağlamak amacıyla genel olarak difüzyon pompası veya turbomoleküler pompalardan (TMP) yararlanılmaktadır (Banarjee ve Mazumdar 2012).

İyon optikleri; iyon kaynağı ve analizör iyon optikleri olmak üzere 2 gruba ayrılmaktadır (Şekil 2.9). İyon kaynağı optikleri; tube lensleri, skimmer, RF lensleri ve LO lenslerinden oluşmaktadır. Kapilerden geçen iyonlar, kütlelerine bağlı olarak tube lensler tarafından uygulanan potansiyel (tube lens voltajı) ile skimmerın girişine doğru yönlendirilmektedir. Skimmer, iyon source bölgesi (yüksek basınç) ile RF lens bölgesi (düşük basınç) arasında vakum ayarlayıcı (baffle) olarak çalışmaktadır. Kapiler tüpün çıkışı, direkt olarak skimmerın girişine denk gelecek şekilde ayarlanmaktadır. Böylece, yüklü büyük partiküllerin skimmerdan geçerek analizöre girişi azaltılıp detektördeki gürültü miktarı azaltılmaktadır. RF ve LO lenslerine uygulanan potansiyel ile iyonların analizöre doğru geçişi sağlanmaktadır. Ayrıca LO lensleri vakum ayarlayıcı (baffle) olarak da işlev görmektedir (Anonymous 2009a).

Analizör iyon optikleri; multipole 1, L1 lensler, split lensler ve multipole 2 (octapole)’den oluşmaktadır. Multipole 1 parçaları, cihaza 90°’lik eğim ile yerleştirilerek analizöre girişi istenmeyen nötral bileşiklerin vakum altında ortamdan uzaklaştırılmasını ve iyonların analizöre geçişini sağlamaktadır. L1 lenslerine uygulanan potansiyel ile iyonlar multipole 2’ye doğru ilerlemektedir. Ayrıca L1 lenslerinin vakum ayarlayıcı (baffle) olarak işlevi vardır. Split lensler, iyonların kütle analizörüne girişini başlatmak veya durdurmak için kullanılmaktadır. C-trap’e girmesine izin verilmeyen iyonlar, L1 lensler tarafından uygulanan yüksek voltaj ile ayarlayıcıya doğru saptırılmaktadır. Multipole 2 (octapole), lenslerden geçen iyonların C-trap’e iletilmesini sağlamaktadır (Anonymous 2009a).

C-trap (kavisli lineer tuzak), orbitrap analizörünün hemen yanında bulunan, iyonların analizöre girmeden önce kısa süreli depolandığı bölümdür. C-trap’in başında (gate lens) ve sonunda (trap lens) bulunan lenslere uygulanan potansiyel ile iyon geçişleri ve iyonların bu bölümde tutulması sağlanmaktadır. İyonizasyon kaynakları aralıksız iyon ürettiklerinden dolayı kütle analizörüne varış sırasında iyon kaybı

33

yaşamamak amacıyla iyonların burada toplanması ve sonra analizöre geçmesi önemlidir. Burada önemli olan, C-trap’ten iyonların mümkün olduğunca hızlı bir şekilde analizöre iletilmesidir. İyonlar, lenslere DC voltajı uygulanması ve C-trap’teki RF potansiyelinin hızlı bir şekilde sıfıra düşürülmesi sonucunda C-trap’in çıkışına doğru yönelmektedir. C-trap’ten sonra gelen Z lenslerine uygulanan potansiyel de iyonların orbitrap girişine iletilmesini sağlamaktadır (Marshall ve Hendrickson 2008; Anonymous 2009a).

Şekil 2.9. Orbitrap-Exactive

İyon optikleri ve orbitrap analizörünü çevreleyen vakum manifoldu, bu alanlarda yüksek ve ultra yüksek vakum ortamını sağlamaktadır. Vakum manifoldu kapiler- skimmer bölgesi, kaynak bölgesi ve analizör bölgesi olmak üzere 3 bölmeye ayrılmıştır ve bu bölmelerde vakum sırasıyla ön pompa, turbomoleküler pompa (kaynak TMP) ve diğer turbomoleküler pompa (analizör TMP) ile sağlanmaktadır. Kapiler-skimmer bölgesinden orbitrap analizör bölgesine doğru vakum değeri kademeli olarak artmaktadır. Kapiler-skimmer bölgesi önvakum (FV), multipole 2 ve C-trap bölmesi yüksek vakum (HV) ve orbitrap analizör bölmesi ultra yüksek vakum (UHV) bölgesi olarak adlandırılmaktadır (Anonymous 2009a) (Çizelge 2.4).

Çizelge 2.4. İyon optikleri ve analizördeki vakum değerleri

Bölge Vakum (mbar) Vakum sağlayıcı

Kapiler-skimmer ˂ 2 Ön pompa FV

Multipole 2 1E-05 Kaynak TMP HV

Orbitrap analizör ˂ 8E-10 Analizör TMP UHV

Detektör, analizörde m/z oranlarına göre ayrılan iyonların enerjilerini elektrik enerjisine dönüştürerek, verilerin bilgisayar sisteminde insan gözü tarafından algılanabilen biçimde görüntülenmesini sağlamaktadır (Dass 2007, Westman-

ESI İyon kaynağı Kapiler Tube lens Skimmer RF Lens LO Lens Z Lens Orbitrap Kütle analizörü Gate Lens Trap Lens

Çarpışma Hücresi _C-trap

Multipole 1 L1 Lens

Split Lens Multipole 2

34

Brinkmalm ve Brinkmalm 2009). Kütle spektrometrelerinde kullanılan dedektörler iki ana kategoriye ayrılmaktadır. İlk grupta, yüksek doğrulukta izotop oranlarının ölçüldüğü sektör analizörleri ile birlikte kullanılan, fotoğraf plakası ve Faraday kabı gibi gelen sinyalleri direkt ölçen dedektörler; ikinci grupta ise sintalasyon sayıcı ve elektron çoğaltıcı gibi gelen sinyalleri yeterli yoğunlukta vermek amacıyla artıran sinyal çoğaltıcının (multiplier) kullanıldığı detektörlerdir (Evans 1990). Görüntü akımı dedektörü ise sadece iyon siklotron rezonans ve orbitrap analizörleri ile birlikte kullanılan ve zamana bağlı sinyallerin oluştuğu detektördür. Bu sinyaller elde edildikten sonra Fourier dönüşümü ile frekansa bağlı sinyale yani kütle spektrumuna dönüştürülmektedir (Dass 2007, Westman-Brinkmalm ve Brinkmalm 2009).