Metot

3.2.1. Standart çözeltilerin hazırlanması

Her bir antibiyotiğin stok çözeltisi, derişimi 1000 ppm olacak şekilde çözünürlüklerine bağlı olarak sadece metanolde veya metanol ve aseton karışımında hazırlanmıştır ve -18 °C’de amber renkli tüplerde muhafaza edilmiştir. Araştırmada kullanılan antibiyotiklerin tamamını içeren 5 ppm’lik standart karışım metanol ile hazırlanmıştır ve analizler bu karışım kullanılarak yapılmıştır.

3.2.2. Ekstraksiyon yöntemleri

Bebek gıdaları, QuEChERS ve ASE yöntemleri ile 2 farklı şekilde ekstraksiyon işlemine tabi tutularak analiz edilmiştir.

3.2.2.1. QuEChERS yöntemi

Bebek gıdalarının QuEChERS yöntemine göre ekstraksiyonu için AOAC 2007.01 (2007) yöntemi uygulanmıştır. Bebek gıdaları toz ürünler ve kavanoz mamaları olmak üzere 2 gruba ayrılmıştır.

Toz ürünlerin ekstraksiyon aşamasında, 5 g numune 50 mL’lik santrifüj tüpüne tartılarak üzerine 10 mL ultra saf su ilave edilmiştir ve 30 s elle çalkalanmıştır. Sonra, üzerine 15 mL %1’lik asetik asit içeren asetonitril ilave edilerek tekrar 30 s elle çalkalanmıştır. Daha sonra, 1.5 g susuz sodyum asetat ve 6 g susuz magnezyum sülfat toz karışımı ilave edilmiştir ve 1.5 dk elle çalkalanmıştır. Tüpler, 20 °C’de 4000 rpm’de 5 dk santrifüj (Eppendorf 5810R, Almanya) edilmiştir. Tüpler santrifüj işleminden sonra -18 °C’de bir gece bekletilmiştir. Ekstraktların temizleme (clean-up) aşaması için, 4 mL ekstrakt içerisinde 150 mg PSA (primer sekonder amin), 150 mg C18 ve 900 mg susuz magnezyum sülfat toz karışımı bulunan 15 mL’lik tüplere aktarılmıştır ve tüpler 1.5 dk elle çalkalanmıştır. Tüpler, 20 °C’de 4000 rpm’de 5 dk santrifüj edilmiştir. Daha sonra 0.8 mL ekstrakt viallere aktarılarak analiz edilmiştir.

Kavanoz mamalarının ekstraksiyon aşaması için 15 g numune 50 mL’lik santrifüj tüpüne tartılmıştır. Üzerine 15 mL %1’lik asetik asit içeren asetonitril ilave edilerek tekrar

43

30 s elle çalkalanmıştır. Daha sonra, 1,5 g susuz sodyum asetat ve 6 g susuz magnezyum sülfat toz karışımı ilave edilmiştir ve 1,5 dk elle çalkalanmıştır. Tüpler, 20 °C’de 4000 rpm’de 5 dk santrifüj edilmiştir. Tüpler santrifüj işleminden sonra -18 °C’de bir gece bekletilmiştir. Ekstraktların temizleme aşaması için, 4 mL ekstrakt içerisinde 150 mg PSA, 150 mg C18 ve 900 mg susuz magnezyum sülfat toz karışımı bulunan 15 mL’lik tüplere aktarılmıştır ve tüpler 1,5 dk elle çalkalanmıştır. Tüpler, 20 °C’de 4000 rpm’de 5 dk santrifüj edilmiştir. Daha sonra 0,8 mL ekstrakt viallere aktarılarak analiz edilmiştir.

3.2.2.2. Hızlandırılmış çözgen ekstraksiyonu

Hızlandırılmış çözgen ekstraksiyonu ASE 350 (Dionex, ABD) cihazı kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Toz ürünlerin ve kavanoz mamaların ekstraksiyon aşaması için 5 g numune 10 mL’lik paslanmaz çelikten yapılmış ekstraksiyon hücrelerine tartılmıştır. Hücre kapakları sıkı bir şekilde kapatıldıktan sonra hücreler cihaza yerleştirilmiştir. Ekstraksiyon işleminde kullanılan parametreler Çizelge 3.2’de belirtilmiştir.

Çizelge 3.2. ASE parametreleri

Basınç 1500 psi

Sıcaklık 70 °C

Çözgen %1 asetik asit/asetonitril:metanol (4:1)

Statik süresi 5 dk

Yıkama (Flush) hacmi %60

Döngü sayısı 3

Ekstraksiyon prosesi 6 aşamadan oluşmaktadır. İlk aşamada çözgen hücre içerisine doldurulmaktadır (1 dk). İkinci aşamada içerisinde örnek ve çözgen bulunan hücre ekstraksiyon sıcaklığına kadar ısıtılmaktadır (5 dk). Üçüncü aşamada statik süresi boyunca örnek çözgene maruz kalmaktadır (5 dk). Dördüncü aşamada bir sonraki döngüye geçmeden önce ayarlanan yıkama hacmine bağlı olarak belirli miktarda çözgen hücrenin altında bulunan toplama kaplarına boşaltılırken taze çözgen de hücreye ilave edilmektedir (10 sn). Beşinci aşamada ekstraksiyon işlemi bittikten sonra hücrenin içerisindeki ekstrakt azot gazı aracılığıyla toplama kabına iletilmektedir ve sonra ekstraktın toplama kabına iletildiği hat çözgen ile yıkanmaktadır (1 dk). Son aşamada sistemin basıncı 0 psi’ye düşürülerek sistem bir sonraki ekstraksiyon için hazır hale gelmektedir (1 dk).

Toplama kaplarından 15 ml’lik tüplere 10 mL ekstrakt aktarıldıktan sonra tüpler -18 °C’de bir gece bekletilmiştir. Tüpler, +4 °C’de 4000 rpm’de 5 dk santrifüj edildikten sonra ekstrakt 0,45 µm’lik naylon filtreden geçirilmiştir. Daha sonra 0,8 mL ekstrakt viallere aktarılarak analiz edilmiştir.

44

3.2.3. Ultra yüksek performans sıvı kromatografisi

Araştırmada Accela Ultra Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (Thermo Scientific, ABD) kullanılarak kromatografik ayrım Hypersil Gold aQ (100 mm x 2,1 mm, 1,9 µm, Thermo Scientific, ABD) kolonu ile yapılmıştır. Hareketli faz bileşimleri aşağıda belirtildiği şekilde hazırlandıktan sonra fazlar sonikatörde 10 dk bekletilmiştir (degas).

Hareketli faz (A): 0,5 mM oksalik asit ve 1 mM amonyum format /su Hareketli faz (B): 0,2 mM oksalik asit/metanol

Kolon akış hızı 0,5 mL/dk, kolon sıcaklığı 30 °C ve enjeksiyon hacmi 5 µL’dir. Gradiyent elüsyon kullanılarak yapılan analizin süresi 10 dakikadır (Çizelge 3.3).

Çizelge 3.3. Hareketli faz oranları

3.2.4. Kütle spektrometresi

Analizin kütle spektrometresi ile yapılan kısmında Orbitrap Exactive (Thermo Scientific, Almanya) cihazı kullanılmıştır. Analizler pozitif iyon modunda gerçekleştirilmiştir. Cihazın kütle kalibrasyonu için kafein (m/z 195), Met-Arg-Phe-Ala amino asitlerinin asetat tuzu (MRFA, m/z 524) ve Ultramark 1621 (m/z 1022, 1122, 1222, 1322, 1422, 1522, 1622, 1722, 1822) çözeltilerinin karışımından oluşan pozitif iyon mod kalibrasyon çözeltisi kullanılmıştır. Cihazın kalibrasyonu ve ayarlama (tune) işlemi kullanım rehberinde belirtildiği gibi yapılmıştır (Anonymous 2009b). Cihazın ayarlama işlemi yapılırken elde edilen ekran görüntüsü Ek-1’de verilmiştir. Cihazda Exactive Tune 2.0 ve Xcalibur 2.1 yazılımı kullanılmıştır. Analitlere ait kromatogramlar 5 ppm kütle aralığında (toleransında) ve analit kütleleri virgülden sonra 5 ondalıklı olarak değerlendirilmiştir. Analizörde tespit yapılırken cihazın kontrol panelinde belirtilen tarama (scan) ve iyon kaynağı (HESI) parametrelerinin değerleri Çizelge 3.4’de belirtilmiştir.

Dakika A fazı (%) B fazı (%)

0 100 0 1 100 0 6 25 75 6,1 0 100 8 0 100 9 100 0 10 100 0 Kolonun yıkanması Analitlerin tespit edilmesi

45

Çizelge 3.4. Kontrol panelindeki parametrelerin değerleri

Tarama panelindeki parametreler HESI panelindeki parametreler

Tarama aralığı (m/z) 150-400 Sheath gaz akış hızı 40

Parçalanma HCD gas on Auxiliary gaz akış hızı 10

Çözünürlük Ultra high Sprey voltajı (kV) 4

Polarite Positive Kapiler sıcaklığı (°C) 250

Mikrotarama 1 Kapiler voltajı (V) 60

Kilit kütle Off Tube lens voltajı (V) 120

AGC* Balanced Skimmer voltajı (V) 20

Maksimum enjeksiyon süresi(ms) 20 Isıtıcı sıcaklığı(°C) 350

*Ultra high (100000)

*Automatic gain control (1x106₎ 3.2.5. Metot validasyonu

Metot validasyonu, Avrupa Birliği Komisyon Kararı’na (No:2002/657/EC) uygun olarak yapılmıştır (Anonymous 2002).

3.2.5.1. Doğrusallık ve ölçüm aralığı

Ölçüm aralığının belirlenmesi, metodun uygulama aralığının belirlenmesi açısından önemlidir. Doğruluk ve kesinlik çalışmaları bu aralığı kapsayacak konsantrasyonlarda yapılmaktadır. Doğrusallık, kalibrasyon eğrisinde ölçülen analit konsantrasyonunun ve ölçüm cihazından elde edilen yanıtın doğru orantılı olarak görüldüğü aralıktır. Her bir analit için matriks uyumlu kalibrasyon grafiği altı farklı konsantrasyonda (0, 0.25, 0.5, 1, 2.5, 5 µg/kg) hazırlanmış ve her bir konsantrasyon için iki tekrarlı okuma yapılmıştır. Elde edilen sonuçların doğrusallığı, korelasyon katsayısının karesi (r2_{) hesaplanarak değerlendirilmiştir.}

3.2.5.2. Seçicilik

Seçicilik, analiz için uygulanan metodun, analiti örnek matriksindeki diğer bileşiklerden ayırt edebilme yeteneğidir. Seçicilik, kör numunelerin ve belirli konsantrasyonda analitleri içeren zenginleştirilmiş numunelerin analizi sonucunda elde edilen kromatogramların karşılaştırılması ile belirlenmiştir. Kromatogramlarda analitlerin alıkonma zamanlarında olası girişim unsurlarının olup olmadığı kontrol edilmiştir (Kaklamanos vd 2013).

3.2.5.3. Tespit limiti (LOD) ve tayin limiti (LOQ)

Tespit limiti, zemin gürültüsünden farklı olarak tespit edilebilen fakat değeri tam olarak ölçülemeyen en düşük analit konsantrasyonudur. LOD’nin belirlenmesi için örnek körü üzerine antibiyotik standart karışımından cihazda görülebildiği ve tekrarlanabilirliğinin yapılabildiği en düşük konsantrasyonda analitler ilave edilerek aynı gün içerisinde 10 ayrı analiz yapılmıştır. Yapılan analizler sonucunda elde edilen değerlerin

46

standart sapması hesaplanmış ve bu değerin 3 katı LOD değeri olarak belirtilmiştir. Tayin limiti ise, kabul edilebilir doğrulukta ve kesinlikte ölçülebilen en düşük analit konsantrasyonudur. LOQ, LOD’nin tespit edilmesi için yapılan analizler sonucunda hesaplanan standart sapmanın 10 katı alınarak belirlenmiştir.

3.2.5.4. Doğruluk ve kesinlik

Doğruluk, analiz sonucunda elde edilen verilerin gerçek değere; kesinlik ise ölçüm sonuçlarının birbirine yakınlığını ifade etmektedir. Doğruluk, laboratuvar örneklerinin doğrusal aralıktaki belirli konsantrasyonlarda (0.5, 1, 2.5 µg/kg) standart maddeler ile zenginleştirilerek yapılan geri kazanım çalışmaları sonucunda elde edilen değerler; kesinlik ise elde edilen bu değerlerin bağıl standart sapması (%RSD) ile değerlendirilmiştir. Geri kazanım oranı (%R) ve yüzde bağıl standart sapma değerleri sırasıyla 3.1 ve 3.2’deki denklemler kullanılarak hesaplanmıştır.

(3.1)

(3.2)

Kesinliğin, tekrarlanabilirlik ve tekrarüretilebilirlik olmak üzere 2 ayrı ölçümü mevcuttur. Tekrarlanabilirlik, aynı gün içerisinde 3 farklı konsantrasyonda yapılan ve her bir konsantrasyonda 6 kez tekrarlanan analiz sonucunda elde edilen değerlerin; tekrarüretilebilirlik ise, tekrarlanabilirlik çalışmasının 3 farklı günde yapılması sonucunda elde edilen değerlerin bağıl standart sapması hesaplanarak değerlendirilmiştir.

47

4. BULGULAR VE TARTIŞMA