Elektrosprey iyonizasyon

1912 yılında icat edilen ve ticari olarak 1940lı yıllarda piyasaya sürülen kütle spektrometresi ile 1952 yılında icat edilen ve yağ asitleri, steroidler gibi ısıya dayanıklı bileşiklerin ayrımında kullanılan gaz kromatografisinin 1957 yılında birleştirilmesi, bu güçlü tekniğin biyokimya alanında kullanımına olan ilgiyi artırmıştır. Ancak iyonlaşma işleminde sert iyonizasyon tekniklerinin (EI ve CI) kullanılması proteinler, nükleik asitler ve kompleks karbonhidratlar gibi kompleks biyomoleküllerin yıkımı ile sonuçlanmıştır. Bu tekniğin uçucu bileşiklerin ayrılmasında kullanılması ve bu teknik ile proteinlerin yapısında önemli derecede yıkım ve parçalanma olmaksızın gaz fazına geçişini sağlamanın mümkün olmamasından dolayı yumuşak iyonizasyon tekniklerinin geliştirilmesi ön plana çıkmıştır. Yumuşak iyonizasyon, iyonizasyon işlemi sırasında analite minimum düzeyde iç enerjinin aktarıldığını ve parçalanmanın düşük olduğunu ifade etmektedir (El-Aneed vd 2009). ESI tekniği 1968 yılında Malcom Dole ve çalışma arkadaşları tarafından keşfedildikten sonra, 1984 yılında Masarmichi Yamashita ve John Fenn tarafından da kütle spektrometresi ile birleştirilmiştir (Westman-Brinkmalm ve Brinkmalm 2009). John Fenn’in biyolojik makromoleküllerin kütle spektrometresinde analizi için ESI tekniğini geliştirmesinden dolayı 2002 yılında kimya alanında Nobel ödülü alması, bu tekniğin biyokimya, biyomedikal ve farmakolojik araştırma alanlarında kullanımının önemini artırmıştır (Kebarle ve Verkerk 2010). Zamanla LC- MS sistemlerinde kullanılan en önemli arayüz parçası olmuştur. APCI tekniği gibi atmosferik basınç altında gerçekleşen ESI, APCI tekniğinin aksine, yüksek molekül ağırlıklı, ısıya duyarlı ve polar bileşiklerin iyonizasyonu için kullanılmaktadır. (Blasco ve Picó 2007).

ESI tekniği temel olarak 2 elektrot sisteminden oluşmaktadır. Elektrotlardan biri, çözelti ile temas halinde olan metal kapiler tüptür ve elektrospreyin yüklü damlacıkların oluştuğu kısmında yer almaktadır. Bu elektrot, yayıcı (emitter) elektrot olarak adlandırılmakta ve analitik açıdan reaksiyonlar bu elektrotta meydana gelmektedir. İkinci elektrot veya karşıt (counter) elektrot ise, kütle spetrometresinin bir parçası olan örnekleme konisi veya örneğin analizöre geçişini sağlayan giriş kapiler aparatlarından biridir (Berkel ve Kertesz 2007). ESI tekniğinin prensibi, atmosferik basınçta sürekli akış halinde olan ve analit moleküllerini içeren uçucu polar çözücünün, paslanmaz çelik kapiler tüpten (yayıcı elektrot) geçerken, bu tüpün uç kısmına yüksek elektrik voltajı (3- 5 kV) uygulanması sonucunda kapiler tüpün ucu ile analizörün girişi (karşıt elektrot) arasında oluşan elektriksel alanda yüklü damlacıklar halinde dağılmasına dayanmaktadır

24

(Ho vd 2003, Berkel ve Kertesz 2007, Dass 2007). Uygulanan bu teknikte, analit fragmentlerine çok az düzeyde ayrılmakta veya hiç ayrılmamaktadır. Kapiler tüpün dış yüzeyinden, sıvı ile aynı eksen doğrultusunda akan sheath gaz (kuru N2) sprey oluşumunu daha iyi hale getirmektedir. Bu gaz, aynı zamanda kapilerin ucundan gelen yüklü partiküllerin analizörün girişine ulaşmasına yardımcı olmaktadır (Banarjee ve Mazumdar 2012).

ESI kullanılarak moleküllerin çözeltiden gaz fazına geçişi 3 aşamada gerçekleşmektedir: (1) yüklü damlacıkların ince partiküller halinde dağılması (2) çözücünün buharlaştırılması (3) yük oranı yüksek damlacıklardan iyonların açığa çıkması (Ho vd 2003, Lavagnini vd 2006, Kebarle ve Verkerk 2010). İlk aşama kapsamında, kapiler tüpün içinden geçerken sıvının yapısında burada oluşan potansiyel farktan dolayı değişimler gözlenmektedir. İletken sıvı kuvvetli elektriksel alana maruz kaldığında, bu sıvının yapısındaki yükler Coulomb yasasına bağlı olarak ayrılmaktadır. Elektroforetik hareket, ayrışan katyonları (pozitif modda) elektriksel alanın en kuvvetli olduğu noktaya (kapilerin uç yüzeyi) doğru iletirken, anyonları ise iki elektrotu birbirine bağlayan ve bunlara elektrik potansiyeli sağlayan metal tel üzerinden yüzeyden uzaklaştırmaktadır. Bu yük ayrımı sıvıda yeni bir kuvvetin oluşmasına neden olmakta ve sıvının yüzey gerilimi bu kuvveti etkisiz hale getiremediği zaman sıvı kapilerin ucunda konik bir yapı halini almaktadır. Bu yapıya Taylor konisi denilmektedir. Sisteme uygulanan yüksek elektrik voltajı sonucunda oluşan elektriksel kuvvetler yüzey gerilimini yenerek sıvının, koninin tepe noktasından damlacıklar halinde ayrılmasını sağlamaktadır (Bökman 2002, Kebarle ve Verkerk 2010).

İkinci aşamada, elektrosprey ucun çıkışında oluşan yüklü damlacıklar ortamdaki potansiyel değişimden dolayı sheath gaz akışının yardımıyla kütle spektrometresinin analizör girişine (karşıt elektrot) doğru sürüklenmektedir. Bu sırada, damlacıklara sıcak azot gazı (auxiliary gaz) uygulanmasıyla çözücü buharlaşmakta ve yüklü damlacıkların boyutu azalmakta ancak yük miktarı sabit kalmaktadır. Damlacık boyutunun azalması, yüzeydeki yük yoğunluğunu ve dolayısıyla yüklerin elektrostatik itme gücünü artırmaktadır. Sonuç olarak, belirli bir noktada (Rayleigh limit) damlacıklar stabil olmayan bir hal almakta ve Coulombik kuvvetler yüzey gerilimini aşarak damlacıkların bölünmesine (fizyon) neden olmaktadır. Üçüncü aşamada, devam eden çözücü evaporasyonu ile birlikte damlacık boyutu oldukça küçülmekte ve sürekli parçalanma sonucunda damlacıkların yapısındaki analit iyonları gaz fazında açığa çıkmaktadır (Bökman 2002, Kebarle ve Verkerk 2010). Şekil 2.5’de ESI sisteminde iyonların oluşumu belirtilmiştir (Westman-Brinkmalm ve Brinkmalm 2009).

ESI sistemlerinde iyonizasyon, analitin ve cihazın özelliklerine bağlı olarak birçok parametreden etkilenmektedir. Bu parametrelerden bir tanesi, asidik özellikteki analitler için pKa veya bazik özellikteki analitler için pKb değeridir. Bu değerler analitin proton (H atomu) alarak veya vererek yük kazanacağını ve buna bağlı olarak iyonizasyon modunun pozitif veya negatif olacağını belirlemek açısından önemlidir (Kebarle ve Verkerk 2010).

25

Şekil 2.5. ESI’de iyon oluşumu

ESI sisteminin en iyi şekilde çalışması açısından çözücü bileşimi ve akış hızı iki önemli değişkendir. Akış hızı, ESI sırasında oluşan damlacıkların hem boyutunu hem de boyut dağılımını belirlemektedir. Genel olarak ESI kaynağı 1-10 µL/dk akış hızında çalışmaktadır. Sprey, daha yüksek akış hızlarında büyük boyutta damlacıklar oluşturarak elektriksel akımda soruna yol açtığı için işlem stabil olmamaktadır. Çözücü bileşimi, sıvıların yüzey gerilimi açısından önemlidir. Saf su gibi yüksek yüzey gerilimine sahip sıvıların elektrosprey işlemi metanol, etanol, izopropanol ve asetonitril gibi çözücülere kıyasla daha zor gerçekleşmektedir (Dass 2007). Ancak gradiyent sistemlerde saf su hareketli faz bileşiminde yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu nedenle, yüzey gerilimi yüksek sıvılara elektrosprey ile iyonlaşması için daha yüksek kapiler voltajı uygulanmaktadır. Örneğin, metanolün iyonlaşması için gerekli olan kapiler voltajı 2.2 kV iken, suyun iyonlaşması için gerekli olan voltaj 4 kV’tur (Kebarle ve Verkerk 2010).

Auxiliary gazın ve kapiler tüpün sıcaklık değerleri iyonlaşma üzerine etkilidir. Auxiliary gazın sıcaklığı, ESI probunun ucunda oluşan damlacıkların analizöre gidiş yolunda çözücünün buharlaşarak uzaklaşması açısından önemlidir (Janusson vd 2015). Damlacıklardan açığa çıkan yüklü iyonlar, kütle spektrometresinin örnekleme konisi girişindeki ısıtılmış kapiler tüpten geçerek analizöre girmektedir. Dış yüzeyini çevreleyen 2 kartuş ısıtıcı tarafından ısıtılan kapiler tüp (genellikle 0.2 mm iç çaplı, 60- 100 mm uzunlukta, 100-400 °C’ye ısıtılabilen), atmosferik basınç ile yüksek vakum ortamları arasında bulunmaktadır. Kapiler, iyonların buradan geçerken tamamen gaz fazına geçişini sağlamaktadır (Banarjee ve Mazumdar 2012). Ayrıca auxiliary ve sheath gaz akış hızları da iyonlaşma işleminde etkilidir (Janusson vd 2015). ESI işlemi sonucunda, analitin iyonları ile birlikte nötral formları da sprey içerisinde mevcuttur. Nötral moleküllerin, iyonlar ile analizöre girmemesi için sprey kapilerinin yönünün, kütle spektrometresinin girişi ile aynı eksen doğrultusunda olmaması gerekmektedir. Genellikle gaz fazına geçen küçük damlacıklar spreyin dış bölgesinde daha yoğun olduğu için ESI probunun, analizör girişinden çok az eksen dışı olacak şekilde konumlandırılması iyonların nötral formlarına göre daha çok analizöre girmesini sağlamaktadır (Cech ve Enke 2001). İyonlaşmayı etkileyen diğer bir faktör analit

Gaz akışı

Taylor konisi Sıvı akışı

Yüksek voltaj

26

konsantrasyonudur. Damlacık yüzey alanına paralel olarak yüzeydeki iyon miktarı da sınırlı olmaktadır. Analit konsantrasyonunun yüksek olduğu durumda, damlacık yüzeyi tamamen analit iyonları ile dolduğu zaman fazla iyonlar damlacıkların iç kısmında sıkışmaktadır (Bökman 2002).

Şekil 2.6. Ion Max yapısı (Manisali vd 2006)