Metot Validasyonu

Bir analitik ölçümün amacı; tutarlı, güvenilir ve doğru verilerin elde edilmesidir. Bu amaca ulaşmada valide edilmiş analitik metotların büyük bir rolü vardır. Metot validasyonu sonucunda elde edilen veriler, iyi bir analitik çalışmanın ayrılmaz bir parçası olarak, analitik sonuçların kalitesini, güvenilirliğini ve tutarlılığını sorgulamak amacıyla kullanılmaktadır. Bir analitik metot, rutin analizlerde kullanılmaya başlanmadan önce ve başka bir laboratuvarda kullanılmak amacıyla transfer edildiğinde valide edilmelidir; ayrıca farklı özellikte bir cihaz veya matriks kullanılması gibi metot şartlarının veya parametrelerinin değiştiği durumlarda valide edilmiş bir metodun tekrar validasyonu yapılmalıdır (Huber 2010). Validasyon, asgari kabul kriterlerini yerine getiren bir metodun kalitesini tarafsız olarak gösteren ve belirli bir amaç için metodun uygulanabilirliğini ispatlayan bir prosedürdür. Bu, özellikle kalite yönetimi ve akreditasyon bağlamında önemli bir konudur (Peters vd 2007).

Metot validasyonu, doğrudan nicel verilerin kalitesini etkilediği için metot geliştirme ile yakından ilgilidir. Validasyon sayesinde geliştirilen metodun kabul edilebilirliği güvence altına alınmaktadır. Analitik metotların validasyonuna ilişkin sayısız kuruluşun farklı ihtiyaçları karşılayan bilgi kaynakları mevcuttur. Bu yüzden, metot validasyonu için rehberlik yapacak uygun kaynağın seçilip uygulanması önemlidir. Temel olarak bu kaynaklar Uluslararası Temel ve Uygulamalı Kimya Birliği (IUPAC), Uluslararası Standardizasyon Komitesi (ISO), Avrupa Analitik Kimya Örgütü (Eurachem) ve Resmi Analitik Kimyagerler Derneği (AOAC International) gibi bağımsız bilimsel kuruluşlar tarafından sağlanmaktadır. Bu kuruluşlar, ulusal/bölgesel düzenleyici otoritelerden ve uluslararası düzenleyici standart ve uygulamaları oluşturan uluslararası kuruluşlardan oluşmaktadır (Kay ve MacNeil 2012).

Validasyonun kapsamı ve değerlendirilecek performans parametrelerinin seçimi analitik yöntemin durumuna göre değişmektedir. Yöntem daha önce uluslararası protokole göre tamamen valide edilmişse, geniş kapsamlı laboratuvar içi (in-house) validasyonun yapılması gerekmemektedir. Ancak, laboratuvar içi yeni geliştirilen metoda ait herhangi bir performans kriteri belirlenmemişse mümkün olduğu kadar çok sayıda validasyon parametresinin (tam validasyon) incelenmesi gerekmektedir (Taverniers vd 2004). Genel olarak metot validasyonu için incelenmesi önerilen performans kriterleri; doğrusallık (linearity), ölçüm aralığı (range), seçicilik (selectivity), tespit limiti (limit of detection-LOD), tayin limiti (limit of quantification-

35

LOQ), doğruluk (accuracy) ve kesinliktir (precision) (Taverniers vd 2004, Peters vd 2007, Huber 2010, Kay ve MacNeil 2012).

Seçicilik, tespit edilecek analitin matriks içerisinde bulunan diğer bileşiklerden (metabolit, safsızlık, diğer matriks bileşenleri) ayırt edilerek ölçülmesini ifade etmektedir. Seçiciliğin belirlenmesi için, kör numuneye (analiti içermeyen örnek) farklı konsantrasyonda aranan analit eklenerek girişim unsurlarının oluşup oluşmadığı incelenmektedir. Bir metodun seçiciliğini metot parametrelerinin yanısıra örnek hazırlama aşamaları da önemli ölçüde etkilemektedir. Günümüzde yüksek çözünürlüklü kütle spektrometreleri ile yapılan çalışmalarda eser miktardaki analitlerin belirlenmesinde çok iyi seçicilik sağlanmaktadır. Kalibrasyon modelinin seçimi analit miktarının güvenilir bir şekilde tespit edilmesi için önemlidir. Bu yüzden analit konsantrasyonu ile cihazda vermiş olduğu sinyal arasındaki ilişki incelenmelidir. Bu açıdan, doğrusallık ve ölçüm aralığı analitik çalışmalarda belirlenmesi gereken iki önemli parametredir. Doğrusallık, analit konsantrasyonu ile sinyalin doğru orantılı olarak değiştiği alt ve üst sınırları belirtmektedir. Analizlerde analitlerin ölçüm aralığı bu sınırlar içerisinde olmalıdır. Ölçüm aralığının alt sınırını tayin limiti (LOQ) değeri belirlemektedir (Taverniers vd 2004, Peters vd 2007, Huber 2010, Kay ve MacNeil 2012).

Doğruluk, analiz sonucunda elde edilen verilerin gerçek değere yakınlığını ifade etmektedir. Doğruluk, gerçeklik ve kesinlik parametrelerini kapsamaktadır. Gerçeklik, bir değerin bilinen gerçek değere yakınlığını (sapma-bias) belirtmektedir. Bu değer, bir ölçüm metodunun gerçek sonucu verebilme kabiliyetini ifade eden sistematik hatalardan etkilenmektedir. Gerçek değer, sertifikalı referans maddelerin kullanıldığı valide edilmiş bir metot uygulanarak belirlenmektedir. Ancak sertifikalı referans madde ve metodun bulunmadığı durumlarda geri kazanım çalışması yapılarak da belirlenebilmektedir. Bu kapsamda validasyon çalışmasının yapılacağı matrikse (blank) tespit edilecek analit bilinen konsantrasyonda ilave edilerek analiz edilmektedir. Kesinlik ise, aynı örnekten elde edilen ölçüm sonuçlarının birbirine yakınlığını ifade etmektedir. Kesinlik tekrarlanabilirlik (repeatability), ara kesinlik (intermediate precision) ve tekrarüretilebilirlik (reproducibility) olmak üzere 3 farklı şekilde belirlenmektedir. Tekrarlanabilirlik örneklerin aynı laboratuvarda aynı ekipman kullanılarak aynı analist tarafından kısa zaman aralığında analiz edilmesi sonucunda verilerin elde edilmesi; ara kesinlik aynı laboratuvarda farklı günlerde farklı analistler tarafından yapılan analiz sonuçlarının elde edilmesi ve tekrarüretilebilirlik ise aynı metodun farklı laboratuvarda uygulanması sonucunda verilerin elde edilmesi olarak tanımlamaktadır. Bir metodun kesinliği standart sapma veya bağıl standart sapma (RSD) değeri ile belirlenmektedir (Taverniers vd 2004, Peters vd 2007, Huber 2010, Kay ve MacNeil 2012).

Eser miktarda analit konsantrasyonlarında çalışılması durumunda analit sinyalinin kör numune sinyalinden ayrılması ve uygun bir kesinlikte sonuçların elde edilmesi daha da önem arz etmektedir. Bu durum için tespit limiti ve tayin limiti kavramları oluşturulmuştur. Tespit limiti, örnek içerisinde yer alan analitin tespit edilebilen fakat değeri tam olarak ölçülemeyen en düşük miktarı ya da konsantrasyonudur. Kromatogramda bu değer, analit pikinin yüksekliğinin (sinyal-S) temel taban çizgisinden (baseline) yani gürültü seviyesinden (N) en az 3 kat yüksek olmasını ifade etmektedir. Tespit limitinin altında kalan nicel verilerin ölçümü

36

yapılabilmektedir ancak bu değerlerin ölçümündeki belirsizlik gerçek değerden oldukça yüksek olduğu için ölçümler doğru ve kesin olmamaktadır. Tayin limiti ise örnek içerisindeki analitin kabul edilebilir doğrulukta ve kesinlikte ölçülebilen en düşük miktarını ya da konsantrasyonunu ifade etmektedir ve raporlama limiti olarak da bilinmektedir. Genellikle tespit limiti ve tayin limiti en düşük konsantrasyonda analitin örnek körü üzerine eklenerek yapılan çoklu analiz sonuçlarının standart sapmasının hesaplanması ile elde edilmektedir. Belirlenen standart sapmanın 3 ile çarpılması sonucunda tespit limiti, 10 ile çarpılması sonucunda tayin limiti hesaplanmaktadır. Bu sayılar, sırasıyla ölçümlerde maksimum kabul edilebilir bağıl belirsizlik yüzdeleri olan %33 ve %10 değerlerinin karşılığı olan katsayılardır (Taverniers vd 2004, Peters vd 2007, Huber 2010, Kay ve MacNeil 2012).

2.6. Gıdalarda Kütle Spektrometresi Kullanılarak Yapılan Sülfonamid Grubu