OHCHO-Eski Havana Kent Tarihçileri Ofisi (KÜBA)

O método de disco-difusão, descrito por Anderson e modificado por Kirby e Bauer, vem sendo empregado com sucesso na bacteriologia desde 1966, com a finalidade de determinar a susceptibilidade de bactérias a antimicrobianos, apresentando ótima correlação clínico-laboratorial. Tendo em vista sua simplicidade operacional e bons resultados obtidos na bacteriologia é de extrema importância a tentativa de adaptar esta metodologia para os ensaios com antifúngicos (Bauer et al., 1966; Jorgensen et al., 1977; NCCLS, 1993; ).

Nas décadas de 70 e 80, vários autores trabalharam com o método de disco-difusão em micologia utilizando discos de 5-FC, anfotericina- B, miconazol e clotrimazol. Entretanto, os trabalhos foram realizados com diferentes metodologias, sendo difícil a comparação entre seus resultados. Da mesma forma, não houve preocupação dos autores no desenvolvimento de estudos que possibilitassem a padronização de diferentes variáveis fundamentais para garantir consistência e reprodutibilidade nos ensaios (Marks, Eickhoff, 1970; Utz, Shadomy, 1977; Grendahl, Sung, 1978; Saubolle, Hoeprich, 1978; Casals, 1979; Torres-Rodríguez et al., 1990).

Na década de 90, após a padronização do método de microdiluição em caldo, o NCCLS designou um subcomitê para padronizar o teste de disco-difusão frente a leveduras, onde vários estudos foram realizados analisando as variáveis mais importantes na acurácia dos ensaios, incluindo o meio a ser utilizado, a temperatura, o tempo de incubação, o disco contendo antifúngico e a determinação dos critérios de leitura do teste (Pfaller et al., 1992; Sandven et al., 1993; Barry, Brown, 1996).

O meio de cultura a ser utilizado no teste de disco-difusão deve ser capaz de suportar crescimento adequado dos microrganismos a serem testados, sem causar qualquer interação com a atividade das drogas utilizadas no ensaio. Têm sido preconizados meios de composição química completamente definida, para viabilizar a reprodutibilidade dos ensaios (Hoeprich et al.,1970; Hoeprich, Finn,1972; Radetsky, 1986).

Barry, Brown (1996) propuseram estudo com o método de disco- difusão utilizando o meio RPMI-1640 com 2% glicose e 1,5% de ágar, levando em conta os bons resultados deste meio nos ensaios de microdiluição em caldo padronizados pelo NCCLS M27-T (1995). Neste estudo, os autores observaram que o meio RPMI parece não ser apropriado para testar algumas espécies de leveduras que apresentam pobre crescimento nesse meio, como foi visto para amostras de C. glabrata e C. krusei, que apresentaram crescimento satisfatório

somente após 48h de incubação.

Estudos posteriores foram realizados a fim de encontrar um meio mais adequado para o teste de disco-difusão na rotina de laboratórios clínicos. Barry et al. (2002) avaliaram a utilização de dois meios para o método de disco-

difusão a fluconazol, testando 495 isolados de Candida spp.: meio Mueller-

Hinton ágar (MHA) suplementado com glicose e azul de metileno e o meio RPMI-1640 ágar suplementado com glicose. Os resultados do teste de disco- difusão para os dois meios foram comparados com os resultados do método de referência (microdiluição em caldo). A correlação dos resultados para os dois meios avaliados foi maior para a leitura de 24h com MHA (96,9%), sendo menor com o meio RPMI (93,6%). Já em relação a leitura de 48h, houve menor concordância para ensaios com ambos os meios testados: MHA (93,3%) e RPMI (93,5%). Pode-se verificar que com a utilização do meio RPMI as

tempo maior (48h) para a leitura do teste. Também houve problemas com três

isolados de C. krusei e duas amostras de C. albicans. Para ensaios com o meio

MHA suplementado com glicose e azul de metileno houve melhor crescimento para todos os isolados de diferentes espécies testadas e melhor definição do halo de inibição, respectivamente. Os autores verificaram que ensaios de disco-difusão utilizando o meio MHA apresentaram maior compatibilidade com os resultados da microdiluição, suportando melhor o crescimento para as diferentes espécies de leveduras avaliadas. Além disso, os resultados gerados pelo teste de disco-difusão após 24h de incubação apresentaram maior reprodutibilidade que aqueles obtidos após 48h de incubação.

Rubio et al. (2003) desenvolveram estudo para avaliar a performance de três meios em relação ao teste de disco-difusão: meio MHA suplementado com dextrose e azul de metileno, meio RPMI-1640 com glicose e

o meio Shadomy (SHDM). Foram selecionados 150 isolados de Candida spp.

provenientes de pacientes admitidos no Hospital Universitário Lozano Blesa, Espanha. Os resultados do teste de disco-difusão para os três meios avaliados foram comparados com os resultados do método de microdiluição em caldo (NCCLS M27-A2). A correlação dos resultados após 24h de incubação foi maior para o meio MHA (95,3%), sendo um pouco menor para os meios RPMI (94%) e SHDM (92,6%). Em relação as leituras de 48h também houve maior correlação com o meio MHA (94,6%), sendo menor para os meios SHDM (91,3%) e RPMI (75,3%). O crescimento de microcolônias dentro do halo de inibição foi comum para os meios RPMI (63,4%) e SHDM (64,7%), sendo infrequente para o meio MHA (8,7%). O meio MHA apresentou um halo de inibição claro e definido em 91,3% dos testes de disco-difusão. Com este estudo, os autores concluíram que o meio MHA parece ser o meio ideal para o método de disco-difusão devido à menor ocorrência de crescimento de microcolônias dentro do halo de inibição, facilitando a leitura do teste e minimizando qualquer subjetividade. Da mesma forma, o MHA apresentou melhores índices de equivalência com os resultados gerados pelo método de referência NCCLS M27-A2 (2002).

Barry et al. (2003) propuseram trabalho colaborativo internacional envolvendo oito instituições para definir os limites do halo de inibição para as cepas-controle a serem utilizadas nos testes de disco-difusão com fluconazol, em meio MHA suplementado com glicose e azul de metileno. As oito instituições avaliaram em dez dias distintos, três cepas-controle como controle

de qualidade (CQ) para definir o tamanho do halo de inibição: C. albicans

(ATCC 90028), C. parapsilosis (ATCC 22019), C. tropicalis (ATCC 750). Os

resultados gerados pelas cepas-controle foram: C. albicans variaram de 28 a

39mm, para C. parapsilosis variaram de 22 a 33mm e para C. tropicalis

variaram de 26 a 37mm. Os autores concluíram que houve maior reprodutibilidade com leitura de 24h de incubação em todos os ensaios. Os resultados mostraram também que a adição de azul de metileno ao meio MHA define melhor o halo de inibição, produzindo um halo de inibição com razoável

grau de precisão quando avaliadas as cepas-controle C. albicans (ATCC

90028), C. parapsilosis (ATCC 22019) e C. tropicalis (ATCC 750).

Pfaller et al. (2004d) realizaram estudo similar ao citado anteriormente, mas para determinar os resultados de leitura para o controle de qualidade no teste de disco-difusão a voriconazol com o meio MHA suplementado com glicose e azul de metileno. Foram utilizadas três cepas-

controle no ensaio: C. albicans (ATCC 90028), C. parapsilosis (ATCC 22019) e

C. krusei (ATCC 6258). Assim como no teste para fluconazol, foram realizadas

leituras de 24h e 48h para determinar o impacto do tempo de incubação nas leituras para este método. Os resultados gerados pelas cepas-controle foram: ATCC 90028 – (31 a 42mm), ATCC 22019 - (28 a 37mm) e ATCC 6258 – (16 a 25mm). Os autores concluíram que, assim como reportado para os testes com fluconazol, houve melhor performance dos resultados com leitura de 24h de incubação para voriconazol. Pode-se também estabelecer a confiabilidade das

cepas-controle como parâmetros para interpretação dos testes: C. albicans

Os trabalhos de Barry et al. (2003) e Pfaller et al. (2004d) avaliando as cepas-controle foram fundamentais para consolidar a leitura de 24h como melhor parâmetro de leitura para o teste de disco-difusão, como também para permitir o uso de cepas-padrão no controle de qualidade destes ensaios em laboratórios de rotina.

Uma vez definida a melhor condição de realização do método de disco-difusão, foi importante avaliar qual a sua correlação com o método referência de diluição em caldo do NCCLS M27A-2 (2002), na categorização dos isolados como: susceptível, SDD ou resistente.

Barry et al. (2002) compararam os métodos de disco-difusão e microdiluição em caldo para avaliar o perfil de susceptibilidade a antifúngicos

frente a 495 isolados de Candida spp.. Através de uma curva de regressão

linear os autores correlacionaram o tamanho do halo inibitório do teste de disco-difusão com os valores das CIMs gerados pelo método de microdiluição. Todas as espécies avaliadas para a susceptibilidade foram interpretadas frente

a três categorias: isolado susceptível - se observado valores das CIMs de ≤

8µg/mL ou diâmetro do halo de ≥19mm; amostra SDD - se observado valores

das CIMs de 16 a 32µg/mL ou diâmetro do halo de 15 a 18mm; isolado

resistente - se observado valores das CIMs de ≥ 64µg/mL ou diâmetro do halo

de ≤ 14mm. Os resultados do teste de microdiluição em caldo tiveram uma

concordância de 97% com o método de disco-difusão. A correlação entre as duas metodologias foi realizada frente a três resultados de discrepância: erro gravíssimo (a espécie testada apresenta susceptibilidade para o teste de disco- difusão e resistência para o método de microdiluição em caldo); erro grave (a espécie avaliada apresenta resistência para o teste de disco-difusão, sendo susceptível para o método de microdiluição); e erro leve (a espécie apresenta SDD para um teste e susceptível ou resistente para o outro método). Os

resultados mostraram erro gravíssimo somente para uma amostra de C. krusei,

não apresentando ocorrência de erro grave. Houve a presença de 14 erros leves envolvendo oito isolados de C. krusei, três isolados de C. parapsilosis,

duas amostras de C. glabrata e um isolado de C. albicans. Os autores

concluíram que os resultados do teste de susceptibilidade a fluconazol pelo método de disco-difusão tiveram boa equivalência com o método de microdiluição em caldo, tendo aplicação potencial em laboratórios de rotina para a triagem de amostras resistentes a fluconazol.

Matar et al. (2003) avaliaram a concordância do método de disco- difusão com o teste de microdiluição em caldo padronizado pelo NCCLS M27- A2 (2002) frente a fluconazol e voriconazol. Foram avaliadas 400 amostras de

Candida spp. isoladas de hemocultura. Os diâmetros dos halos de inibição

foram interpretados com base no estudo prévio de Barry et al. (2002). A

concordância entre as categorias de susceptibilidade a fluconazol, considerando resultados gerados pelo teste de disco-difusão e microdiluição em caldo, foi de 88,8% para leitura de 24h. Erro gravíssimo foi observado em 15 amostras testadas, não ocorrendo erro grave. Houve a presença de 14 erros leves para os isolados testados. Em relação a voriconazol, como ainda não foram definidos os pontos de corte de susceptibilidade, foi realizada apenas análise descritiva dos resultados dos métodos de microdiluição e teste de disco-difusão após 24h de incubação. Esses dados sugerem que apesar da boa equivalência entre os métodos, o teste de disco-difusão tem melhor performance na identificação de amostras susceptíveis e algumas limitações no reconhecimento de amostras resistentes.

Finquelievich et al. (2003) conduziram estudo para avaliar o teste de disco-difusão para fluconazol comparando os resultados com o método de microdiluição em caldo padronizado pelo NCCLS M27-A2 (2002), sendo

testados 290 isolados de Candida spp. A concordância entre as duas

metodologias foi de 90%. Foram identificadas 258 amostras susceptíveis para o método de microdiluição, em contrapartida com 245 isolados para o teste de

disco-difusão, com concordância de categoria de 99,6%. Houve 13 amostras SDD para o teste de microdiluição e 21 isolados para o método de disco- difusão. Em relação a resistência, houve 19 amostras para o teste de microdiluição e 21 isolados para o método de disco-difusão. Não ocorreu erro gravíssimo na correlação dos dois métodos. Entretanto, erro grave ocorreu em 1,03% dos isolados testados e erro leve em 8,97% das espécies avaliadas. Os resultados sugerem que o método de disco-difusão tem boa correlação com o teste de referência para determinar amostras susceptíveis a fluconazol. Já a menor correlação entre as duas metodologias para SDD e resistência pode ter

ocorrido devido ao fenônemo in vitro conhecido como “trailing”, sendo

caracterizado pelo crescimento reduzido mais persistente de alguns isolados de Candida spp. na presença de drogas fungistáticas. Este fenômeno pode

prejudicar a leitura e, por conseguinte, o resultado final do ensaio de disco- difusão.

Pfaller et al. (2004e) avaliaram a acurácia dos resultados do teste de disco- difusão comparado ao método de microdiluição em caldo a fluconazol dos laboratórios participantes do projeto ARTEMIS. Foram selecionados 2.949

isolados de Candida spp. com significância clínica nos sítios de infecção

(sangue e sítios estéreis) causando infecção invasiva em pacientes de diversos hospitais sentinela da América do Norte, América Latina, Europa, África e Ásia. Estas amostras foram posteriormente enviadas para o laboratório central em Iowa (EUA) para comparação dos resultados obtidos entre as duas metodologias. Através de uma curva de regressão linear foram correlacionados o tamanho do halo inibitório do teste de disco-difusão com os valores das CIMs gerados pelo método de microdiluição. Foi realizado monitoramento do diâmetro do halo do disco relatado em 54 diferentes centros médicos entre 2001 e 2002. A concordância entre as metodologias avaliadas foi maior para o laboratório referência (92,8%), sendo menor entre os laboratórios participantes

(87,4%). A concordância entre as metodologias foi maior para amostras de C. albicans (97,7%) não apresentando erro gravíssimo, ocorrência de 1,4% dos

isolados com erro grave e 0,9% das amostras com erro leve. Para ensaios com

C. tropicalis houve concordância de 87,7%, apresentando erro gravíssimo em

7,3% dos isolados, 3,4% das amostras com erro grave e 0,6% de erro leve. A

concordância para isolados de C. parapsilosis foi de 85,5%, apresentando erro

gravíssimo em 9,7% dos isolados, 4,8% das amostras com erro grave e

nenhum erro leve. Houve menor concordância para os isolados de C. glabrata

(60,6%), com ocorrência de erro gravíssimo em 31,3% dos isolados, erro grave para 7,4% das amostras e erro leve para 0,7% dos isolados. Este estudo foi de grande importância para validação da performance do teste de disco-difusão de acordo com o NCCLS M44-A (2004), no programa de vigilância antifúngica entre os laboratórios participantes e o centro de referência em Iowa.

Baseado nos resultados mencionados anteriormente, o NCCLS padronizou o método de disco-difusão através do documento M44-A (2004), utilizando o meio MHA suplementado com dextrose e azul de metileno, o

tamanho do inóculo de 0,5 a 2,5x103 UFC/mL preparado com o auxílio de

espectrofotometria, a temperatura de incubação de 35oC e com tempo de

leitura de 24h.

O teste de disco-difusão proporciona um resultado rápido, de baixo custo, não exigindo equipamento especial, proporcionando resultados qualitativos de fácil interpretação, podendo assim ser utilizado em laboratórios

de rotina avaliando a susceptibilidade de espécies de Candida para discos de

fluconazol e voriconazol. Entretanto, é necessário cautela na interpretação de

resultados de disco-difusão em ensaios envolvendo amostras de C. glabrata e

C. krusei, onde o crescimento inadequado da espécie testada pode ocasionar

resultado de falsa susceptibilidade.