3 KENTSEL TASARIM PROJE SÜREÇLERĠNĠN
3.3 Bulguların Değerlendirmesi
5.1 Preparo do liofilizado do chá de ayahuasca
O chá de ayahuasca foi concentrado com o auxílio de um rota- evaporador modelo FISATON, até o chá atingir um volume de cerca de 10% do volume inicial. Em seguida o concentrado foi colocado em frasco apropriado e congelado a –40ºC em banho de gelo seco e acetona, e colocado em um liofilizador, a -4 ATM de pressão por cerca de 48h para a obtenção do resíduo seco (liofilizado).
O liofilizado obtido foi armazenado em frasco âmbar, dentro de um dessecador em geladeira. Quantidades apropriadas foram pesadas e diluídas em água destilada, no momento dos testes.
5.2 Doseamento dos componentes do chá de ayahuasca
As concentrações de DMT e alcalóides β-carbolinas (harmina, harmalina e tetrahidro-harmina) foram dosadas em colaboração com o Prof. Dr. Maurício Yonamine da Universidade de São Paulo (USP), conforme metodologia descrita abaixo (Pires et al. 2009a).
5.2.1 Preparação das soluções padrão
Soluções padrão (10 mg/mL) de dimetiltriptamina, harmina, harmalina e tetrahidro-harmina, foram preparadas com metanol em um balão volumétrico. As concentrações injetadas no cromatógrafo gasoso foram de 1 mg/mL, as quais foram obtidas através da diluição da solução estoque.
5.2.2 Extração dos alcalóides da ayahuasca
Uma amostra contendo 0,5 mL de ayahuasca em um tampão de borato (pH 9.0; 3,0 mL) contendo difenidramina (100 µL de uma solução contendo 1,0 mg/mL) como padrão interno, foi colocada em um cartucho de C18 sob vácuo e acondicionada com metanol (2,0 mL), água deionizada (1,0 mL) e tampão de borato (pH 9.0; 3,0 mL). O cartucho foi lavado, posteriormente com água deionizada (1,0 mL) e com uma solução de acetonitrila-água (1:9; 1,0 mL). O cartucho foi secado sob vácuo durante 7 min, e os alcalóides foram extraídos
Metodologia
com metanol (2,0 mL). Foi injetado no cromatógrafo gasoso 1,0 µL desta solução. Os alcalóides extraídos foram identificados através da comparação de seus respectivos tempos de retenção com aqueles obtidos com os padrões analisados nas mesmas condições cromatográficas. A quantificação foi baseada sobre a integração da área do pico obtida com o padrão interno.5.2.3 Análise usando cromatografia gasosa acoplada com a espectrometria de massas
A análise de dimetiltriptamina, harmina, harmalina e tetrahidro-harmina foi realizada usando um cromatógrafo gasoso Agilent modelo 6890, equipado com um detector de nitrogênio-fósforo e um injetor automático 7683 (Little Falls, DE, USA). A separação cromatográfica foi obtida com uma coluna capilar fundida com sílica HP – ultra 2 (25 m x 0,2 mm x 0,33 micrometros de espessura) usando nitrogênio ultra puro como gás de arraste com um fluxo constante de 0,6 mL/min. Foi injetado 1 µL de amostra no modo “split” (razão 1:20). As temperaturas do injetor e detector foram de 200-250 ºC, respectivamente. A temperatura do forno foi mantida a 150ºC durante 1,0 minuto, com uma taxa de aquecimento programada para 10ºC/min até 250ºC, sendo mantido em 250ºC durante 7 min. O limite de detecção e menor limite de quantificação foram determinados por um método empírico que consistiu na análise de uma série de soluções aquosas contendo quantidades decrescentes de dimetiltriptamina, harmina, harmalina e tetrahidro-harmina.
Metodologia
5.3 Rendimento do chá de ayahuasca e definição das doses
As doses do chá de ayahuasca utilizadas neste trabalho foram estabelecidas em função das doses consumidas pelo homem durante um ritual. De acordo com o Dr. Wilson, que forneceu o chá de ayahuasca, o volume ingerido nas sessões ritualísticas varia em função da concentração do chá. Além disso, cada seita ou cada pessoa ingere uma quantidade diferente de chá dependendo dos efeitos que pretende obter. Todo esse procedimento ocorre com a autorização do “mestre”, que é a pessoa que acompanha os rituais para orientação dos participantes.
Assim, utilizou-se para o cálculo da “dose unitária” o volume médio consumido durante um ritual, de aproximadamente 70 mL, de acordo com o volume apontado pelo Dr. Wilson (medido em um copinho plástico). Uma vez que a liofilização de 100 mL do chá de ayahuasca produziu um rendimento de 12g, verificou-se que o chá encontra-se na concentração de 0,12g/mL. Calcula- se, portanto, que em um copo de 70 mL há 8,4g de sólido, o que significa que um homem de 70 kg (peso médio) estará recebendo o equivalente a 120 mg/kg (8,4g/70 kg). Esta dose foi escolhida como a dose unitária do trabalho.
Doses equivalentes a 0,1X (12 mg/kg), a ritualística 1X (120 mg/kg) e 10X (1200 mg/kg) foram escolhidas para a realização dos testes. A dose equivalente a 10 vezes a dose unitária ingerida em ritual foi escolhida com a finalidade de obter-se eventualmente um efeito farmacológico mais visível. Foi ainda utilizada a dose de 2400 mg/kg (20X) na triagem farmacológica inicial.
Metodologia
5.4 Caracterização do liofilizado do chá
Foram analisados os seguintes parâmetros do chá liofilizado: cor, odor, sabor e pH. O pH foi determinado em pHmetro CORNIG 125, previamente calibrado com soluções tampão de fosfato pH 7 e biftalato pH 4, utilizando soluções do chá, nas concentrações de 0,12 g/mL e 1,2 g/mL.
5.5 Teste do “screening” farmacológico do chá de ayahuasca
Os camundongos foram distribuídos em grupos de cinco para cada uma das seguintes doses do extrato: 0,1X (12 mg/kg), 1X (120 mg/kg), 10X (1200 mg/kg) e 20X (2400 mg/kg) administradas por via oral (gavagem), além de um grupo controle que recebeu água. Para testar a administração por via intraperitoneal (ip), os animais foram distribuídos em grupos de três camundongos para cada uma das seguintes doses: 0,1X, 1X, 10X.
Numa segunda etapa, o mesmo experimento foi realizado avaliando os efeitos do propofol, ou morfina isolados ou em associação com o chá. O chá de ayahuasca 1X foi administrado 30 min antes do propofol 50 e 140 mg/kg (ip), ou morfina 10 e 20 mg/kg (ip) ou salina (ip).
Os animais foram colocados em gaiolas de arame (Figura 4), com dois ou três animais por gaiola, e observados aos 5, 15, 30, 60, 120, 180, 240 min e 24h após a administração das drogas, anotando-se a presença ou ausência de sinais de acordo com o protocolo rotineiramente empregado no Departamento de Psicobiologia, tais como: micção, defecação, “writhes”, pêlos arrepiados, atividade locomotora, tremor, convulsões, ataxia, perda do reflexo de postura, sensibilidade dolorosa, ptose palpebral, cauda de “Straub”, abdução das patas posteriores, estereotipia, bocejos, sono, “grooming” excessivo, tônus muscular, lacrimejamento, exoftalmia, salivação e morte (Carlini, 1972; Mendes, 2000). Ao fim de 24h os animais foram eutanasiados e o fígado, rins e coração examinados macroscopicamente, e comparados com os controles.
Metodologia
Este experimento serviu para estipular doses para os demais testes e traçar um perfil inicial da atividade da droga testada. Os sinais apresentados não foram quantificados numericamente, ou seja, foi realizada uma observação qualitativa e anotado o número de camundongos que apresentou o sinal observado.Figura 4: gaiola de arame utilizada
para observação dos sinais
apresentados pelos animais no teste do “screening” farmacológico.
Metodologia
5.6 Teste do rota-rod
Este teste consiste em avaliar a coordenação motora dos camundongos que são colocados sobre uma barra giratória a 12 rpm (rotações por min) aos tempos 0 (basal), 30, 60 e 120 min após a administração das drogas (Carlini & Burgos, 1979; Mendes et al., 2002) (Figura 5).
Realizou-se uma pré-seleção de camundongos nesse aparelho 24h antes do teste, separando para o estudo somente aqueles que conseguiram permanecer na barra por 60 seg em até 3 tentativas.