3. MATERYAL ve YÖNTEM
3.6 Normalizasyon ve Ġstatistiksel Analizler
Külleme ve külleme + MeJa uygulanmıĢ bitkilere ait transkript profilleri; kontrol profilleri ve referans gen (aktin) ile karĢılaĢtırılmıĢtır. Elde edilen verilerin istatistiksel olarak değerlendirilmesi Livak ve Schmittgen‘in 2-ΔΔCT formülü ile ve One Way ANOVA (Dunnet) ile yapılmıĢtır (Livak ve Schmittgen 2001). Varyans analizi iki ya da daha fazla gruba ait ortalamalar arasındaki farkın anlamlı olup olmadığı ile ilgili hipotezleri test etmek için kullanılmıĢtır. Eğer ikiden fazla grubun ortalamaları karĢılaĢtırılacak ise F Testi diğer bir ismiyle Varyans Analizi (ANOVA, Analysis Of Variance) uygulanmıĢtır. AraĢtırmacıların bir kontrol grubunu birden fazla deney grubu ile karĢılaĢtırması gerektiğinde Dunnet testini kullanmaları önerilmektedir (Dunnet 1955). Bu yolla stres uygulamalarında farklılaĢan gen ifadesi sonuçları referans gen olan aktin ve kontrol profilleri dikkate alınarak normalize edilmiĢtir (Livak ve Schmittgen 2001). Bu verilerin ortalama, standart sapma, standart hata ve istatistiksel olarak anlamlılık dereceleri istatistik programı (SPSS 18) ile hesaplanmıĢtır. Bu Ģekilde külleme ve külleme + MeJa stresi uygulanmıĢ bitkilerde 4 genin mRNA ifade seviyesi tespit edilmiĢtir (Gunduzer 2015). Sig değerinin küçük olması, külleme ve külleme + MeJa streslerinde zamana bağlı olarak gen ifadesi seviyesinde meydana gelen değiĢikliğin p<0,05 düzeyinde istatistiksel olarak anlamlı olduğunu ifade etmektedir.
Sig değerinini küçük olması karĢılaĢtırılan grupların ortalamaları arasında anlamlı bir fark olduğuna karar vermektedir. Varyans analizi karĢılatırılan grupların hangileri arasında fark olduğunu bildiremez. Bu nedenle anlamlı fark bulunduğu zaman bu farkın hangi gruplar arasındaki farktan kaynaklandığını bulmak amacı ile Post-hoc testi yapılmıĢtır.
54 4. ARAġTIRMA BULGULARI VE TARTIġMA
4.1 Erysiphe necator ve MeJa Uygulamaları sonrası
Külleme etmeninin binoküler mikroskop görüntüleri Ģekil 4.1‘de gösterilmiĢtir.
Külleme inokülasyonu ve örnek toplama iĢlemleri bittikten sonra, denemenin devamında uygulama yapılan saksılarda külleme hastalığının geliĢme Ģiddeti gözlemlenmiĢ ve tüm çeĢitlerin farklı derecelerde hastalık etmenine maruz kaldıkları görülmüĢtür. Küllemeye hassas Boğazkere ve Cabernet Sauvignon (ġekil 4.2 - 4.3) ve küllemeye farklı derecede tolerant Regent ve Kishmish Vatkana çeĢitlerine ait görüntüler (ġekil 4.4 - 4.5) aĢağıda verilmiĢtir.
ġekil 4.1 Külleme etmeninin binoküler mikroskop görüntüleri
55
ġekil 4.2 Külleme etmeninin 30.06.2017 tarihinde Boğazkere çeĢidinde yayılıĢı
ġekil 4.3 Külleme etmeninin 30.06.2017 tarihinde Cabernet Sauvignon çeĢidinde yayılıĢı
56
ġekil 4.4 Külleme etmeninin 30.06.2017 tarihinde Regent çeĢidinde yayılıĢı
ġekil 4.5 Külleme etmeninin 30.06.2017 tarihinde Kishmish Vatkana çeĢidinde yayılıĢı
57 4.2 RNA Ġzolasyonu ve cDNA Sentezi
RNA izolasyonu ve cDNA sentezinden sonra Nanodropta ölçülen RNA ve cDNA saflık ve miktar ölçüm sonuçları çizelge 4.1-4.4‘de verilmiĢtir. Ölçüm sonuçları kit protokolünde belirtildiği gibi bulunmuĢtur.
Çizelge 4.1 Boğazkere çeĢidinin RNA ve cDNA saflık ve miktar değerleri
RNA saflık ve miktarı cDNA saflık ve miktarı UYGULAMA SAAT ng/ul 260/280 260/230 ng/ul 260/280 260/230
58
Çizelge 4.2 Regent çeĢidinin RNA ve cDNA saflık ve miktar değerleri
RNA saflık ve miktarı cDNA saflık ve miktarı UYGULAMA SAAT ng/ul 260/280 260/230 ng/ul 260/280 260/230
59
Çizelge 4.3 Cabernet Sauvignon çeĢidinin RNA ve cDNA saflık ve miktar değerleri
RNA saflık ve miktarı cDNA saflık ve miktarı UYGULAMA SAAT ng/ul 260/280 260/230 ng/ul 260/280 260/230
60
Çizelge 4.4 Kishmish Vatkana çeĢidinin RNA ve cDNA saflık ve miktar değerleri
RNA saflık ve miktarı cDNA saflık ve miktarı UYGULAMA SAAT ng/ul 260/280 260/230 ng/ul 260/280 260/230
Real-time PCR reaksiyonu ile elde edilen pik profillerden her bir örneğe ait Ct değerleri belirlenmiĢtir. 4 çeĢide (Boğazkere, Regent, Cabernet Sauvignon, Kishmish Vatkana)
61
ait 4 gen bölgesinin (Myc2, WRKY1, DHN1a, Actin1) Ct değerleri çizelge 4.5 - 4.8‘de verilmiĢtir.
Çizelge 4.5 Boğazkere çeĢidine ait 4 gen bölgesinin Ct değerleri
BOĞAZKERE WRKY1 Ct
Külleme+MeJa-6.saat 24,42 25,21 25,07 22,92
Külleme+MeJa-6.saat 24,76 24,89 24,84 22,55
Külleme+MeJa -12.saat 24,29 23,97 24,83 22,46
Külleme+MeJa -120.saat 24,86 25,14 25,30 21,93
Külleme+MeJa -120.saat 24,91 25,48 25,12 21,98
62
Çizelge 4.6 Regent çeĢidine ait 4 gen bölgesinin Ct değerleri
REGENT WRKY1 Ct
Külleme+MeJa-6.saat 24,66 24,68 24,33 22,41
Külleme+MeJa-6.saat 24,12 24,38 24,98 23,17
Külleme+MeJa -12.saat 24,31 22,95 24,92 22,60
Külleme+MeJa -120.saat 25,38 22,52 25,84 22,92
Külleme+MeJa -120.saat 24,92 22,61 25,53 22,96
63
Çizelge 4.7 Cabernet Sauvignon çeĢidine ait 4 gen bölgesinin Ct değerleri
Cabernet Sauvignon WRKY1 Ct
Külleme+MeJa-6.saat 25,50 25,02 24,89 23,08
Külleme+MeJa-6.saat 24,32 25,12 24,77 23,46
Külleme+MeJa -12.saat 23,92 22,48 24,07 22,89
Külleme+MeJa -120.saat 25,35 25,23 26,81 23,33
Külleme+MeJa -120.saat 25,17 25,67 26,99 23,22
64
Çizelge 4.8 Kishmish Vatkana çeĢidine ait 4 gen bölgesinin Ct değerleri
Kishmish Vatkana WRKY1 Ct
Külleme+MeJa-6.saat 25,73 25,21 26,64 23,12
Külleme+MeJa-6.saat 25,91 24,84 27,62 22,50
Külleme+MeJa -12.saat 23,49 22,21 25,61 21,08
Külleme+MeJa -120.saat 23,92 23,40 27,97 23,73
Külleme+MeJa -120.saat 24,37 23,89 27,53 23,65
65 4.4 Normalizasyon ve Ġstatistiksel Analizler
AraĢtırmada kullanılan çeĢitlere 0., 6., 12., 24., 48., 72., 96. ve 120. saatlerde külleme ve külleme + MeJa uygulamaları yapılarak, stres koĢullarında Myc2, WRKY1 ve DHN1a gen ifadelerindeki farklılıklar tespit edilmiĢtir. Bu amaçla kontrol ve çeĢitler yukarıdaki genlere ait primerler kullanılarak, Real-time PCR reaksiyonu ile verdikleri yanıtlar belirlenmiĢtir. ÇeĢitlerin genlere verdiği yanıtlar istatistiksel olarak 2-ΔΔCT formülü ile değerlendirilmiĢtir.
AraĢtırmada kullanılan çeĢitlerin külleme, külleme + MeJa uygulamaları ve bunların birbirleri ile olan karĢılaĢtırmaları ve uygulamalar sonrası çeĢitlerin birbirleri ile karĢılaĢtırılması amacıyla gen ifadelerine ait grafikler çizilmiĢtir (ġekil 4.6 - 4.47).
4.4.1 Boğazkere çeĢidinin gen ifade seviyeleri
4.4.1.1 Boğazkere çeĢidinin Myc2 gen ifade seviyeleri
Boğazkere (Vitis vinifera L. küllemeye hassas) çeĢidinin külleme uygulamasına karĢı yanıtında Myc2 gen ifadesinde en güçlü ifadesini 6. saatte yapmıĢtır. 6. saatte kontrole göre yaklaĢık 5 kat bir ifade artıĢı görülmüĢ ve bitkinin stres ile karĢılaĢtığı ilk an olduğu düĢünülmektedir. Bunun dıĢında 12., 24. ve 48. saatlerde kontrole göre çok az bir artıĢ görülmüĢtür. 72. ve 96. saatlerde kontrole göre bir miktar azalma göstermiĢtir.
72. ve 96. saatlerdeki azalıĢ ile 24. saatteki küçük artıĢ istatistiksel olarak anlamsız bulunmuĢtur. 120. saatte külleme etmeni 6. saatten bile fazla bir artıĢ sergilemiĢtir (6 kattan fazla) (ġekil 4.6).
66
ġekil 4.6 Külleme uygulanmıĢ örneklerin Boğazkere çeĢidinde Myc2 gen ifade seviyesi
Boğazkere çeĢidinin külleme + MeJa uygulamasına karĢı yanıtında Myc2 gen ifadesinde en güçlü ifadesini 12. saatte yapmıĢtır. 12. saatte kontrole göre yaklaĢık 14 kat bir ifade artıĢı görülmüĢtür. Diğer saatlerde de kontrole göre devamlı bir artıĢ görüldüğü belirlenmiĢtir. 6. saatte 12 kat, 24. saatte ~ 3,5 kat, 48. saatte 6 kat, 72. saatte
~ 7,5 kat, 96. saatte ~ 6,5 kat, 120. saatte ise ~ 6 kat bir ifade artıĢı görülmüĢtür.
Ġncelenen tüm saatlerde kontrole göre önemli derecede artıĢların tespit edilmesi, MeJa‘nın Myc2 gen bölgesi üzerinde bir etkiye sahip olduğunu açık bir Ģekilde göstermektedir. Elde edilen sonuçlar istatistiksel olarak da tüm zaman dilimlerinde meydana gelen artıĢların anlamlı olduğunu göstermektedir (ġekil 4.7). Lorenzo vd.
(2004) Myc2 geni JA-duyarlı genleri pozitif olarak düzenlediğini bildirmektedir.
Küllemeye hassas Boğazkere çeĢidinde de MeJa‘nın etkisinin pozitif yönde olduğu veri sonuçlarında açık bir Ģekilde görülmüĢtür.
0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00
0h 6h 12h 24h 48h 72h 96h 120h
Myc2 Gen Ġfade Seviyesi
Örnek Alım Zamanı
Myc2 Boğazkere Külleme
67
ġekil 4.7 Külleme + MeJa uygulanmıĢ örneklerin Boğazkere çeĢidinde Myc2 gen ifade seviyesi
Boğazkere çeĢidinde külleme ve külleme + MeJa uygulamalarını karĢılaĢtırıldığında, MeJa‘nın bitki savunmasında Myc2 gen ifadesi için ne kadar etkili olduğu daha açık olarak ortaya çıkmaktadır. Ġki grafiğin karĢılaĢtırılmasında (ġekil 4.8), MeJa uygulaması Myc2 gen ifadesinde önemli artıĢlar sağlamıĢtır. 6. (2,5 kat), 12. (9,5 kat), 24. (3,5 kat), 48. (3,5 kat), 72. (8 kat) ve 96. (7 kat) saatlerde küllemeye karĢı önemli bir savunma göstermiĢtir. 120. saatte kontrole göre her iki uygulamada da artıĢ varken, uygulamaların birbirine göre bir artıĢ sağlamadığı görülmüĢtür. Bu nedenle Boğazkere çeĢidinde bu iki uygulama için Myc2 gen bölgesinde 120. saatin dikkate alınmaması, değerlendirmeler açısından daha sağlıklı olacaktır.
0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00
0h 6h 12h 24h 48h 72h 96h 120h
Myc2 Gen Ġfade Seviyesi
Örnek Alım Zamanı
Myc2 Boğazkere Külleme+MeJa
68
ġekil 4.8 Külleme ve külleme + MeJa uygulanmıĢ örneklerin Boğazkere çeĢidinde Myc2 gen ifade seviyelerinin karĢılaĢtırılması
4.4.1.2 Boğazkere çeĢidinin WRKY1 gen ifade seviyeleri
Boğazkere (Vitis vinifera L. küllemeye hassas) çeĢidinin külleme uygulamasına karĢı yanıtında WRKY1 gen ifadesinde kontrole göre azalan bir ifade göstermiĢtir. Bu etmenin WRKY1 genini en çok baskıladığı zaman dilimleri, 24. ve 48. saatler olarak belirlenmiĢtir (ġekil 4.9). Külleme etmeninin WRKY1 gen ifadesi üzerinde en az etkili olduğu zaman dilimleri 12., 72. ve 120. saatlerdir. Genel olarak külleme etmeninin WRKY1 gen ifadesini baskıladığı sonucu ortaya çıkmıĢtır.
0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00
0h 6h 12h 24h 48h 72h 96h 120h
Boğazkere Myc2 KarĢılaĢtırma
Boğazkere Myc2 Külleme Boğazkere Myc2 Külleme+MeJa
69
ġekil 4.9 Külleme uygulanmıĢ örneklerin Boğazkere çeĢidinde WRKY1 gen ifade seviyesi
Boğazkere çeĢidinin külleme + MeJa uygulamasına karĢı yanıtında WRKY1 gen ifadesinde kontrole göre yine azalan bir ifade görülmüĢtür. Külleme + MeJa uygulaması WRKY1 gen ifadesini büyük ölçüde baskılamıĢtır. En çok baskıladığı saatler 24., 48., 72., 96. ve 120. saatlerdir. En az etkili olduğu saatler ise 6. ve 12. saatlerdir (ġekil 4.10).
WRKY1 geninin SA sinyaliyle aracılık edilen ―HR‖ (Hypersensitive Response) ve JA/Etilen sinyaliyle aktive edilen farklı bir savunma yanıtları seti içeren sinyal yolaklarına dahil olabileceği öngörülmüĢtür (Marchive vd. 2007). Marchive vd. (2007) çalıĢmalarında SA uygulamasından sonra 4. ve 8. saatlerde transkript birikiminin maksimuma ulaĢtığını ve 24. saatten sonra azalmaya baĢladığı belirlemiĢtir, araĢtırmada tüm sinyal moleküllerinin (SA, Ethephon veya H2O2 gibi) uygulamadan sonra 2. saatte VvWRKY1 ifadesinde artıĢa neden olduğu gözlenmiĢtir. AraĢtırmamızda ise MeJa uygulamasının Boğazkere çeĢidinde WRKY1 ifadesini 24. saatten sonra azalttığı söylenebilir.
0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20
0h 6h 12h 24h 48h 72h 96h 120h
WRKY1 Gen Ġfade Seviyesi
Örnek Alım Zamanı
WRKY1 Boğazkere Külleme
70
ġekil 4.10 Külleme + MeJa uygulanmıĢ örneklerin Boğazkere çeĢidinde WRKY1 gen ifade seviyesi
Boğazkere çeĢidi için külleme ve külleme + MeJa uygulamalarını karĢılaĢtırdığımızda, WRKY1 gen ifadesinin negatif bir düzenleyici olduğu anlaĢılmıĢtır. Ġki grafiğin karĢılaĢtırılmasında (ġekil 4.11), MeJa uygulaması WRKY1 geninin ifadesini daha da azaltmıĢtır. Ġstatistiksel olarak değerlendirdiğimizde ise tüm zaman dilimlerinde meydana gelen artıĢların p<0,05 düzeyinde anlamlı olduğunu görülmüĢtür.
0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20
0h 6h 12h 24h 48h 72h 96h 120h
WRKY1 Gen Ġfade Seviyesi
Örnek Alım Zamanı
WRKY1 Boğazkere Külleme+MeJa
71
ġekil 4.11 Külleme ve külleme + MeJa uygulanmıĢ örneklerin Boğazkere çeĢidinde WRKY1 gen ifade seviyelerinin karĢılaĢtırılması
4.4.1.3 Boğazkere çeĢidinin DHN1a gen ifade seviyeleri
Boğazkere (Vitis vinifera L. küllemeye hassas) çeĢidinin külleme uygulamasına karĢı yanıtında DHN1a gen ifadesini baskıladığı görülmüĢtür. Özellikle 12. saat külleme etmeninin baskısının en fazla olduğu zaman dilimi olarak ortaya çıkmıĢ, hatta bu zaman diliminde DHN1a gen ifadesinin gerçekleĢmediği tespit edilmiĢtir. AraĢtırma sonuçlarında yalnızca 120. saatte kontrole göre çok az bir artıĢ vardır ve bu artıĢ istatistiksel olarak anlamsız bulunmuĢtur. Diğer zaman dilimlerinde (6., 24., 72. ve 96.
saatler) külleme etmeninin baskısı benzer profil göstermiĢ (ġekil 4.12) ve bu zaman dilimlerinde gen ifadesindeki azalıĢ istatistiksel olarak da anlamlı bulunmuĢtur.
0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20
0h 6h 12h 24h 48h 72h 96h 120h
Boğazkere WRKY1 KarĢılaĢtırma
Boğazkere WRKY1 Külleme Boğazkere WRKY1 Külleme+MeJa
72
ġekil 4.12 Külleme uygulanmıĢ örneklerin Boğazkere çeĢidinde DHN1a gen ifade seviyesi
Boğazkere çeĢidinin külleme + MeJa uygulamasına karĢı yanıtında DHN1a gen ifadesinde kontrole göre önce artan sonra azalan bir ifade görülmüĢtür. MeJa, DHN1a gen ifadesi üzerinde 6. saatte bir miktar artıĢa sebep olmuĢ fakat 12. saatte 2 kat artıĢ göstermiĢtir. Takip eden diğer saatlerde ise DHN1a gen ifadesi kontrole göre azalan bir gen ifadesi belirlenmiĢtir (ġekil 4.13). Ġstatistiksel olarak değerlendirdiğimizde ise 6.
saat dıĢındaki tüm zaman dilimlerinde meydana gelen artıĢ ve azalıĢların p<0,05 düzeyinde anlamlı olduğunu görülmüĢtür.
0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 1,40
0h 6h 12h 24h 48h 72h 96h 120h
DHN1a Gen ifade Seviyesi
Örnek Alım Zamanı
DHN1a Boğazkere Külleme
73
ġekil 4.13 Külleme + MeJa uygulanmıĢ örneklerin Boğazkere çeĢidinde DHN1a gen ifade seviyesi
Boğazkere çeĢidi için külleme ve külleme + MeJa uygulamalarının DHN1a gen ifadesi yönüyle karĢılaĢtırılmasında (ġekil 4.14), MeJa uygulamasının DHN1a geninin ifadesini 12. saate kadar arttırdığı tespit edilmiĢtir. 6. saatte 3,5 kat, 12. saatte ise 29 kat gen ifadesi artarak en güçlü savunma yanıtları bu saatlerde vermiĢtir. 24. saatten itibaren MeJa etkisinin ortadan kalktığı belirlenmiĢtir. Bu sonuçlar özellikle 12. saate kadar MeJa‘nın DHN1a geni üzerinde bitki savunmasında önemli bir rol oynadığını düĢündürmüĢtür.
0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50
0h 6h 12h 24h 48h 72h 96h 120h
DHN1a Gen Ġfade Seviyesi
Örnek Alım Zamanı
DHN1a Boğazkere Külleme+MeJa
74
ġekil 4.14 Külleme ve külleme + MeJa uygulanmıĢ örneklerin Boğazkere çeĢidinde DHN1a gen ifade seviyelerinin karĢılaĢtırılması
4.4.2 Regent ÇeĢidinin Gen Ġfade Seviyeleri
4.4.2.1 Regent çeĢidinin Myc2 gen ifade seviyeleri
Regent (Hibrit Vitis vinifera L. küllemeye tolerant) çeĢidinin külleme uygulamasına karĢı yanıtında Myc2 gen ifadesini baskıladığı ve 48. saat hariç diğer zamanlarda benzer ifade seviyelerine sahip olduğu görülmektedir. 48. saat dıĢında kontrole göre diğer zaman dilimlerinde yaklaĢık 2,5 kat daha az bir ifade gösteren Myc2 geni, 48. saatte kontrole yakın fakat yine de azalan bir ifade göstermiĢtir (ġekil 4.15). Regent çeĢidinde Myc2 geninin negatif olarak düzenlenmesi bu genin baskılanmasında farklı mekanizmaların devrede olduğunu düĢündürmüĢtür. Myc2‘nin JA-bağımlı bitki süreçlerinde yer alan down-stream JA yanıt genlerini düzenleyen, diğer transkripsiyon faktörlerinin transkripsiyonel organizasyonu ile hareket ettiği ileri sürülmüĢtür (Dombrecht vd. 2007).
0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50
0h 6h 12h 24h 48h 72h 96h 120h
Boğazkere DHN1a KarĢılaĢtırma
Boğazkere DHN1a Külleme Boğazkere DHN1a Külleme+MeJa
75
ġekil 4.15 Külleme uygulanmıĢ örneklerin Regent çeĢidinde Myc2 gen ifade seviyesi
Regent çeĢidinin külleme + MeJa uygulamasına karĢı yanıtında Myc2 gen ifadesinde kontrole göre azalan bir ifade gösterdiği belirlenmiĢtir. Özellikle 48. saate kadar azalan bu ifade, 72. saatte önceki 2 saat dilimine göre bir miktar artma göstermekle birlikte, 96.
ve 120. saatlerde tekrar azaldığı gözlenmiĢtir (ġekil 4.16). Myc2 JA yolağında negatif düzenleyici olarak görev yapar (Kazan ve Manners 2013). Tolerant bir çeĢit olan Regent‘te MeJa‘nın bitki savunmasında rol oynadığını kanıtlar niteliktedir.
0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20
0h 6h 12h 24h 48h 72h 96h 120h
Myc2 Gen Ġfade Seviyesi
Örnek Alım Zamanı
Myc2 Regent Külleme
76
ġekil 4.16 Külleme + MeJa uygulanmıĢ örneklerin Regent çeĢidinde Myc2 gen ifade seviyesi
Regent çeĢidi için külleme ve külleme + MeJa uygulamaları Myc2 gen ifadesinin her iki uygulama yönüyle karĢılaĢtırıldığında (ġekil 4.17), MeJa‘nın etkisinin özellikle 6. ve 12. saatlerde neredeyse 2 kat arttığı görülmüĢtür. Sonraki 24. ve 48. saatlerde ise bu etkinin azaldığı görülmüĢtür. 72., 96. ve 120. saatlerde MeJa etkisini Myc2 gen ifadesi üzerinde arttırmaya çalıĢmıĢsa da bu artıĢ fazla olmamıĢtır. Ġstatistiksel olarak da tüm zaman dilimlerinde meydana gelen artıĢların p<0,05 düzeyinde anlamlı olduğu görülmüĢtür. Tolerant bir çeĢit olan Regent çeĢidinde kontrole göre negatif bir ifade gösteren Myc2 geni, MeJa varlığında külleme etmenine karĢı artan bir ifade profili sergilemeye çalıĢmıĢtır.
0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20
0h 6h 12h 24h 48h 72h 96h 120h
Myc2 Gen Ġfade Seviyesi
Örnek Alım Zamanı
Myc2 Regent Külleme+MeJa
77
ġekil 4.17 Külleme ve külleme + MeJa uygulanmıĢ örneklerin Regent çeĢidinde Myc2 gen ifade seviyelerinin karĢılaĢtırılması
4.4.2.2 Regent çeĢidinin WRKY1 gen ifade seviyeleri
Regent (Hibrit Vitis vinifera L. küllemeye tolerant) çeĢidinin külleme uygulamasına karĢı yanıtında WRKY1 gen ifadesi kontrole göre 48. saat dıĢında azalan bir ifade göstermiĢtir. 48. saatteki bu artıĢ istatistik olarak da anlamsız bulunmuĢtur. Külleme etmeninin WRKY1 gen ifadesini özellikle en fazla 96. saatte baskıladığı görülmüĢtür.
6., 12., 24. ve 120. saatlerde benzer ifade profilleri sergilemiĢlerdir (ġekil 4.18).
0,00 0,30 0,60 0,90 1,20
0h 6h 12h 24h 48h 72h 96h 120h
Regent Myc2 KarĢılaĢtırma
Regent Myc2 Külleme Regent Myc2 Külleme+MeJa
78
ġekil 4.18 Külleme uygulanmıĢ örneklerin Regent çeĢidinde WRKY1 gen ifade seviyesi
Regent çeĢidinin külleme + MeJa uygulamasına karĢı yanıtında WRKY1 gen ifadesinde kontrole göre çok olmamakla birlikte 6. ve 12. saatlerde bir artıĢ gözlenmiĢtir. 72.saatte yine kontrole yakın, fakat az bir ifade göstermiĢtir. Bunun dıĢındaki ifadeler kontrolden ve 6., 12. ve 72. saatlerden daha düĢük bir ifade sergilemiĢtir (ġekil 4.19). Tespit edilen 6., 12. ve 72. saat dilimlerindeki artıĢlar da istatistiksel olarak anlamsız bulunmuĢtur.
0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 1,40
0h 6h 12h 24h 48h 72h 96h 120h
WRKY1 Gen Ġfade Seviyesi
Örnek Alım Zamanı
WRKY1 Regent Külleme
79
ġekil 4.19 Külleme + MeJa uygulanmıĢ örneklerin Regent çeĢidinde WRKY1 gen ifade seviyesi
Regent çeĢidi için külleme ve külleme + MeJa uygulamaları WRKY1 gen ifadesi yönüyle karĢılaĢtırıldığında (ġekil 4.20), MeJa‘nın etkisinin 24. saate kadar arttığı gözlenmiĢtir. 48. saatte gen ifadesinde yarı yarıya bir düĢüĢ görülse de, sonraki saatlerde MeJa‘nın etkisinin yine arttığı görülmektedir. 72., 96. ve 120. saatlerdeki bu artıĢlar 6., 12. ve 24. saatlerdeki artıĢlar kadar yüksek değildir. Bu Ģekildeki ifade profili WRKY1 gen ifadesinin MeJa uygulaması ile arttığını göstermiĢtir.
0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 1,40
0h 6h 12h 24h 48h 72h 96h 120h
WRKY1 Gen Ġfade Seviyesi
Örnek Alım Zamanı
WRKY1 Regent Külleme+MeJa
80
ġekil 4.20 Külleme ve külleme + MeJa uygulanmıĢ örneklerin Regent çeĢidinde WRKY1 gen ifade seviyelerinin karĢılaĢtırılması
4.4.2.3 Regent çeĢidinin DHN1a gen ifade seviyeleri
Regent (Hibrit Vitis vinifera L. küllemeye tolerant) çeĢidinin külleme uygulamasına karĢı yanıtında DHN1a gen ifadesi kontrole göre azalan bir ifade göstermiĢtir. Özellikle 6. saatte DHN1a gen ifadesi sıfıra yaklaĢmıĢtır. 12. saatte gen ifadesi yeniden bir yükselme göstermekle birlikte, bu artıĢ kontrole yakın olarak gerçekleĢmiĢtir. Sonraki 24., 48. ve 72. saatlerde benzer ifade profilleri sergileyen DHN1a gen ifadesi, 96. ve 120. saat dilimlerinde 6. saate benzer bir düĢüĢ eğilimi göstermiĢtir (ġekil 4.21).
Dehidrinler, çevresel stres sırasında kuruma hasarından bitki hücrelerini korurlar ve çeĢitli patojenlere karĢı konakçı direncine katılırlar (Yang vd. 2012). DHN1a geninin bu özelliği külleme etmeninin yapraklarda meydana getirdiği stres sonrası, genin aktif olmasında etkili olan yolakları uyardığı Ģeklinde yorumlanmıĢtır. Bu yolaklar özellikle 12. saatte aktif hale geçerek DHN1a geninin ifadesini arttırdığı ancak bu artıĢın kontrole göre negatif bir Ģekilde gerçekleĢtiği düĢünülmüĢtür.
0,00 0,30 0,60 0,90 1,20 1,50
0h 6h 12h 24h 48h 72h 96h 120h
Regent WRKY1 KarĢılaĢtırma
Regent WRKY1 Külleme Regent WRKY1 Külleme+MeJa
81
ġekil 4.21 Külleme uygulanmıĢ örneklerin Regent çeĢidinde DHN1a gen ifade seviyesi
Regent çeĢidinin külleme + MeJa uygulamasına karĢı yanıtında DHN1a gen ifadesinde kontrole göre 6. (1,5 kat) ve 12. (4 kat) saatlerde artan bir ifade göstermiĢlerdir. Ancak, 24. saatte gen ifadesi sıfıra çok yaklaĢmıĢtır. Devam eden 48., 72. ve 96. saatlerde 24.
saate göre gen ifadesi artmıĢ, ancak bu artıĢ kontrole göre yine de daha az olarak gerçekleĢmiĢtir (ġekil 4.22). Bu sonuçlara göre; MeJa‘nın etkisinin 6. ve 12. saatlerde ortaya çıktığı ve bitki savunmasında etkili olduğu düĢünülmüĢtür. Takip eden 24.
saatten 96. saate kadar MeJa‘nın etkisi kaybolmuĢtur. Yang vd.‘nin 2012 yılındaki çalıĢmasında MeJA uygulanmıĢ yapraklardan DHN1 transkriptleri, uygulamadan yaklaĢık 4 saat sonra en yüksek uyarılma ile karĢılaĢmıĢtır. AraĢtırma bulgularımızın 6.
ve 12. saatlerde gen ifadesinin artması bu sonuçları destekler niteliktedir. 120. saatte DHN1a gen ifadesinin kontrole göre 6 kat artıĢ gösterdiği belirlenmiĢtir. Tolerant bir çeĢit olan Regent‘te tespit edilen 120. saatteki yüksek gen ifadesi, bir savunma mekanizması yaratmaya çalıĢtığını düĢündürmüĢtür.
0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20
0h 6h 12h 24h 48h 72h 96h 120h
DHN1a Gen ifade Seviyesi
Örnek Alım Zamanı
DHN1a Regent Külleme
82
ġekil 4.22 Külleme + MeJa uygulanmıĢ örneklerin Regent çeĢidinde DHN1a gen ifade seviyesi
Regent çeĢidi için külleme ve külleme + MeJa uygulamaları yönüyle DHN1a gen ifadesi karĢılaĢtırıldığında (ġekil 4.23), MeJa‘nın etkisinin 6. saatte 37 kat, 120. saatte 32 kart arttığı tespit edilmiĢtir. Bu sonuçlar bir önceki uygulamada olduğu gibi Regent çeĢidinde MeJa uygulamasının DHN1a geninin ifade seviyesini önemli Ģekilde arttırdığı sonucunu pekiĢtirmiĢtir. 12. saat diliminde de ifade seviyesinde artıĢ (5 kat) tespit edilirken, 24. saatte hızlı bir azalma görülmüĢtür. 48., 72. ve 96. saat dilimlerinde ifade düzeyleri birbirine yakın bulunmuĢtur. Ġstatistiksel olarak tüm zaman dilimlerinde meydana gelen artıĢlar p<0,05 düzeyinde anlamlı bulunmuĢtur. AraĢtırma sonuçlarımız Regent çeĢidinde MeJa uygulamasının DHN1a gen ifadesi üzerine pozitif yönde önemli etkide bulunarak, savunmada etkili bir Ģekilde rol oynadığını açıkça göstermiĢtir.
0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00
0h 6h 12h 24h 48h 72h 96h 120h
DHN1a Gen Ġfade Seviyesi
Örnek Alım Zamanı
DHN1a Regent Külleme+MeJa
83
ġekil 4.23 Külleme ve külleme + MeJa uygulanmıĢ örneklerin Regent çeĢidinde DHN1a gen ifade seviyelerinin karĢılaĢtırılması
4.4.3 Kishmish Vatkana ÇeĢidinin Gen Ġfade Seviyeleri
4.4.3.1 Kishmish Vatkana çeĢidinin Myc2 gen ifade seviyeleri
Kishmish Vatkana (Vitis vinifera L. küllemeye tolerant) çeĢidinin külleme uygulamasına yanıtında Myc2 gen ifadesi 6. ve 12. saatlerde kontrole göre çok az bir artıĢ göstermiĢtir. 24. saatte kontrole göre az bir azalıĢ görülmüĢtür. Bunu takip eden 48.
(~3 kat), 72. (2 kat), 96. (~2,5 kat) ve 120. (~2,5 kat) saatlerde ise kontrole göre önemli artıĢlar olmuĢtur (ġekil 4.24). Bu artıĢlar, Kishmish Vatkana‘da savunma ile ilgili mekanizmaların 48. saatten sonra etkin olarak ortaya çıktığı ve Myc2 gen ifadesini pozitif yönde düzenlediği düĢünülmüĢtür.
0,00 0,50 1,00 1,50 2,00 2,50 3,00
0h 6h 12h 24h 48h 72h 96h 120h
Regent DHN1a KarĢılaĢtırma
Regent DHN1a Külleme Regent DHN1a Külleme+MeJa