Dehidrin geni - Transkripsiyon Faktörü Genler

1. GĠRĠġ

1.3 Transkripsiyon Faktörü Genler

1.3.3 Dehidrin geni

Asma dehidrin (DHN) ailesi dört üyeden oluĢmaktadır. Bunlar DHN 1, 2, 3, 4‘tür. Bu 4 genin iĢlevlerinin birbiri içine geçme olasılığı yüksek iken, DHN1‘in ana stres yanıt fonksiyonunu sağladığı anlaĢılmıĢtır. Dehidrinler, çevresel stres sırasında kuruma hasarından bitki hücrelerini korurlar ve çeĢitli patojenlere karĢı konak direnci sağlarlar.

Özellikle DHN1 geni stres koĢullarında ifade bulur. Bu genler geç embriyogenez safhasında kuraklık, düĢük sıcaklık, yüksek tuz, Erysiphe necator ile tetiklendiğinde vejetatif dokularda ifade bulmuĢtur (Nylander vd. 2001, Xu vd. 2008, Kim vd. 2010).

DHN‘ler külleme enfeksiyonuna karĢı yüksek derecede ifade göstererek yanıt vermektedir. Özellikle DHN1 geninin küllemeye karĢı dirençte rol oynadığı görülmüĢtür (Yang vd. 2012). Bununla birlikte, dehidrasyon veya yüksek sıcaklık koĢulları altında proteinlerin bir araya toplanmasını veya inaktivasyonunu önlemek için Ģaperonlar gibi davranarak membran stabilizasyonu yoluyla iĢlevlerini yerine getirebildikleri bildirilmiĢtir (Peng vd. 2008, Kovacs vd. 2008, Brini vd. 2011).

Fosforilasyonun DHN‘lerin substrat bağlanması için önemli bir faktör olduğu bulunmuĢtur (Riera vd. 2004, Alsheikh vd. 2005, Rahman vd. 2011).

Bitkilerde DHN‘lerin birikimi desikasyon (kuruma) toleransı ile iliĢkili olduğu düĢünülmektedir ve bitkisel dokularda bu genlerin ifade seviyeleri genel olarak duyarlı muadillerine göre kuraklığa daha dayanıklı çeĢitlerde daha yüksek olduğu belirlenmiĢtir.

Ancak toleranslı ve duyarlı genotipler arasındaki ifade seviyelerinin farklılığı, stres süresince DHN genlerine bağlıdır (Hanana vd. 2014).

Normal büyüme koĢulları altında DHN1‘in esas olarak tohumlarda ifade edilmekte ve köklerde çok düĢük seviyelerde bulunmaktadır. DHN2, tüm dokularda yapısal olarak ifade bulurken, yaprak ve saplarda, çalıĢılan diğer organlardan daha düĢük seviyelerde ifade bulmaktadır. DHN1 ve DHN2, çiçeklenmeden 6 gün önce çiçek tomurcuklarında ifade bulmakta, sonra transkriptleri embriyogenezin orta evrelerinde azalmakta ve ilerleyen safhalarda bir kez daha artan ifade göstermektedir. DHN3 geni son derece düĢük seviyelerde tohum geliĢimi sırasında ifade bulmuĢtur. Tohum geliĢiminin hem orta hem de geç dönemlerinde düĢük DHN3 seviyeleri tespit edilirken, DHN4 transkriptleri ‗Ben-düĢme‘den hemen önce geliĢen pik ifadesi ile sadece embriyogenezin geç safhaları sırasında saptanabilmiĢtir. Bu sonuçlar, sırasıyla Vitis vinifera L. ve Vitis yeshanensis DHN gen ailelerini oluĢturan dört DHN geninin, çalıĢılan organlarda çok farklı ifade Ģekilleri sergilediğini göstermektedir (Yang vd.

2012).

DHN1 geni kuraklık, soğuk, sıcak, embriyogenezis ve absisik asit (ABA), Salisilik asit (SA) ve Metil jasmonat (MeJA) uygulaması ile Vitis vinifera L. ve Vitis yeshanensis’de indüklenmiĢtir. DHN2 geni soğuk, sıcak, embriyogenez ve ABA ile Vitis vinifera L. ve

Vitis yeshanensis’de indüklenmiĢtir. Ancak kuraklık, Erysiphe necator enfeksiyonu, SA veya MeJA‘ya yanıt vermemiĢtir. Ne DHN3 ne de DHN4, yapılan herhangi bir uygulamaya (biyotik ve abiyotik streslere ve sinyal moleküllerine) yanıt vermemiĢtir (Yang vd. 2012, ġekil 1.9).

ġekil 1.9 Dehidrinler ile ilgili bir sinyal yolağı (https://bmcplantbiol.biomedcentral.com 2018e)

Asma külleme etmeni Erysiphe necator ile inokülasyondan sonra Vitis yeshanensis ve Vitis vinifera L.‘de DHN1 artan bir ifade göstermiĢtir. DHN1‘in ifade seviyesi, dirençli Vitis yeshanensis’de duyarlı Vitis vinifera L.‘den daha yüksek bulunmuĢtur ve Vitis vinifera L.‘de eksik olan ikinci bir indüksiyon olayı Vitis yeshanensis‘de de görülmüĢtür (Yang vd. 2012). MeJA uygulanmıĢ yapraklardan DHN1 transkriptleri, uygulamadan bir süre sonra maksimum indüksiyona ulaĢmıĢtır. Vitis vinifera L.‘de DHN1, savunma yanıtında yer aldığı bilinen SA ve MeJA sinyal molekülleri tarafından indüklenerek sistemik kazanılmıĢ dirençte (Systemic Acquired Resistance-SAR) rol oynamaktadır (Pieterse vd. 2009).

Bu araĢtırma ile, WRKY1, DHN1a ve Myc2 genlerinin külleme (Eryshpe necator) etmeni varlığında nasıl bir cevap oluĢturduğu ve MeJa uygulamasının külleme (Eryshpe necator) hastalığına dayanım üzerine etkisi; WRKY1, DHN1a ve Myc2 genlerinde Real-time PCR ile ifade seviyeleri karĢılaĢtırılarak belirlenmeye çalıĢılmıĢtır. Bu sayede ilerleyen çalıĢmalarda MeJa gen ifadesinin artırılarak, asmalara doğal yollardan dayanıklılık özelliğinin kazandırılması hedeflenmiĢtir.

Bu çalıĢma ile ülkemizde ve dünyada her geçen gün daha büyük bir problem olarak karĢımıza çıkan ve asmalarda verim ve kaliteyi olumsuz yönde etkileyen külleme hastalığına karĢı bitkilerin savunma ürünlerinden olan MeJa‘ın gen ifade seviyeleri Real-time PCR teknolojisi kullanılarak incelenmiĢtir.

Hastalığa karĢı duyarlı ve farklı seviyede tolerant dört farklı asma çeĢidinde külleme ile enfekte genotiplerdeki gen ifade seviyeleri ve külleme ile enfekte ve MeJa uygulanmıĢ genotiplerdeki gen ifade seviyeleri karĢılaĢtırılmıĢtır. Bu Ģekilde MeJa‘ın külleme etmenine karĢı etkisi yukarıda verilen üç gen düzeyinde belirlenmiĢtir. Bu çalıĢma sonuçlarının küllemeye dayanıklı asma ıslahı çalıĢmalarına önemli katkı sağlayacağı düĢünülmektedir.

21 2. KAYNAK ÖZETLERĠ

Asma, verim ve Ģarap kalitesini etkileyen çeĢitli hastalıklara maruz kalmaktadır. Bağda pestisitlerin aĢırı kullanımını sınırlandırmak için alternatif stratejiler geliĢtirilmelidir.

Elisitörler gibi sinyal moleküllerinin bitkiye uygulanması doğal savunma mekanizmalarını uyarır. Belhadj vd. (2006)‘nin çalıĢmasında, Metil jasmonatın (MeJa) asma doğal savunmalarını uyarma kapasitesi kontrol edilmiĢtir. MeJa uygulanan yapraklar, patojenez ile ilgili proteinleri kodlayan ve stilben biyosentezinde (antimikrobiyal bileĢikler) yer alan enzimleri kodlayan artan transkript seviyeleri tarafından reaksiyona girmiĢtir. Bu durum, bu moleküllerin birikimi ile korelasyon göstermiĢtir. MeJa‘nın ortaya çıkardığı aktivite, asma çeliklerinin % 75 ve bağın % 73 oranında küllemeye karĢı artan toleransı ile doğrulanmıĢtır. Bu nedenle MeJa, asmaların korunmasında etkili bir elisitör olabilir.

Patojen saldırısı, genel olarak bağcılık ve tarım için önemli bir problemdir. Günümüzde, fitokimyasalların kullanımı giderek daha da kısıtlanmıĢtır ve bu nedenle, savunma mekanizmaları hakkında kapsamlı bir bilgiye sahip olarak hastalığı kontrol altına almak önem kazanmaktadır. Marchive vd. (2007), potansiyel olarak bitki savunma yanıtı olan WRKY proteinlerinin kontrolünde yer alan trans-regülatör proteinler üzerinde yoğunlaĢmıĢlardır. Asmada VvWRKY1 gen ifadesi geliĢimsel bir Ģekilde tanelerde ve yapraklarda ayrıca, Salisilik asit, Etilen ve Hidrojen peroksit gibi savunma ile ilgili çeĢitli sinyal molekülleri tarafından düzenlenir. Biyokimyasal analiz, VvWRKY1‘in çeĢitli nükleotidik ortamlarda W-box ile spesifik olarak etkileĢime girdiğini belirtir.

VvWRKY1‘in iĢlevsel analizi, tütünde aĢırı ifade bulmuĢtur ve transgenik bitkilerin çeĢitli funguslara karĢı duyarlılığı azalmıĢtır. Bu sonuçlar, fungal patojenlerine karĢı asma savunmasında VvWRKY1‘in bir rolü olduğunu göstermektedir.

Asma (Vitis vinifera L.), Plasmopara viticola, Erysiphe necator, Botrytis cinerea ve Eutypa lata gibi birçok patojene karĢı duyarlıdır. Patojen enfeksiyonlarını azaltmak için bağlarda yaygın olarak pestisitler kullanılır, ancak pestisite dirençli patojen suĢlarının ortaya çıkıĢı ve çevreyi koruma gereksinimi alternatif stratejilerin kullanılmasını gerektirir. Hastalık direncinin geliĢmesinde fitohormon etilenin bir rol oynadığı

düĢünülmektedir. Belhadj vd. (2008)‘nin yaptığı baĢka bir çalıĢmada, asma çeliklerine (Cabernet Sauvignon) etilen salınımlı ethephon uygulanmıĢtır. Bu, patogenez ile iliĢkili proteinin (CHIT4c, PIN, PGIP ve GLU) gen kopyalarının sayısının artmasına ve stilbenlerin (antimikrobiyal bileĢikler) birikimi ile iliĢkili olan PAL ve STS genlerinin uyarılmasıyla fitoaleksin biyosentezinin güçlendirilmesine neden olmuĢtur. Ayrıca, ethephon uygulaması, külleme etmeni Erysiphe necator‘a karĢı asma çeliklerinin korunmasını sağlamıĢtır. Bu çalıĢmalar asma savunmasında etilenin rolünü vurgulamıĢtır.

Asma, külleme fungusu Erysiphe necator‘a karĢı geniĢ bir yelpazede direnç gösterir, ancak küllemeye karĢı savunmanın transkripsiyonel temeli hakkında çok az Ģey bilinmektedir. Fung vd. (2008), mikroskobik gözlemler, küllemenin hif geliĢiminin daha az olduğunu ve küllemeye dirençli Vitis aestivalis ‗Norton‘un yapraklarında küllemeye duyarlı Vitis vinifera L. ‗Cabernet Sauvignon‘un yapraklarından daha fazla kahverenkli epidermal hücreleri uyardığı belirlemiĢlerdir. Fungus yokluğunda, endojen (iç kaynaklı) Salisilik asit seviyelerinin Vitis aestivalis‘lerde Vitis vinifera L.‘ye göre daha yüksek olduğunu ve külleme ile inokülasyondan 120 saat sonra Vitis vinifera L.‘de Salisilik asit düzeylerinin arttığını bulunmuĢtur. Külleme ile enfekte olmuĢ Vitis vinifera L.‘de EDS1 (Enhanced Dısease Susceptıbılıty1), MAPK (Mitogen-Activated Protein Kinase), WRKY, PR1 (Pathogenesıs-Related1), PR10 (Pathogenesıs-Related10) ve STS (Stilben Sintazı) kodlayan transkriptlerin seviyelerinde önemli bir artıĢ bulunmuĢtur, bu da bazal savunma (priming) yanıtının uyarıldığı Ģeklinde yorumlanmıĢtır. Küllemeye yanıt veren Vitis vinifera transkriptomundaki tüm değiĢikliklerin yanı sıra, sekonder metabolitlerin artan sentezine yönelik metabolizmanın yeniden programlanabileceğini de göstermiĢtir.

Bu sonuçlar, Vitis aestivalis‘de küllemeye karĢı direncin transkriptomun tamamen yeniden programlanması ile iliĢkili olmadığını ileri sürmektedir ve külleme, Vitis vinifera‘da savunma amaçlı transkripsiyonel değiĢiklikler baĢlatmaktadır.

Faurie vd. (2009)‘nin yaptığı çalıĢmanın amacı, Metil jasmonat ve etilenin sinerjik olarak asma çeliklerinin (Vitis vinifera L.) savunma mekanizmalarını uyarıp uyarmadığını ve Erysiphe necator‘a karĢı direnci arttırıp arttırmadığını belirlemekti.

Asma çeliklerine (Cabernet Sauvignon) Metil jasmonat ile etilen salınımlı ethephon

birlikte uygulanmıĢtır. Bu birlikte uygulama tek baĢına MeJA veya ethephonun neden olduğu külleme direncini arttırmamıĢtır. Asma hücre süspansiyonları üzerinde yapılan kantitatif PCR analizi, ethephon/MeJA birlikteliğinin, sinerjik olarak PAL ve STS genlerini indükleyerek fitoaleksin biyosentezinde bir artıĢa neden olduğunu göstermiĢtir. Bu gen ifadesi, HPLC analizi ile değerlendirilen stilbenlerin birikimi ile iliĢkilidir. Bununla birlikte, ethephon esas olarak ilk 18 saat süresince, PR protein gen ifadesinin MeJA bağımlı indüksiyonunu inhibe etmiĢtir. Fitoaleksin üretiminde sinerjik bir etki gözlemlenmesine rağmen, fungusa karĢı geliĢtirilmiĢ bir direnç elde edilememiĢtir.

Külleme etmeni, hücre ölümünü tetiklemeden duyarlı bitki hücrelerini istila eden zorunlu biyotrofik patojenlerdir. Bu da küllemenin konakçı tarafından savunmayı algılamasını veya kaçmasını önler. Bitki-patojen etkileĢimini daha iyi anlamak için, Fekete vd. (2009), asma Erysiphe necator Schwein‘e karĢı özellikle ifadesi artan asma (Vitis vinifera L.) genlerinin tanımlanması için SSH (suppression subtractive hybridization), diferansiyel hibridizasyon ve quantitative Real-time (qRT) PCR kullanmıĢlardır. Duyarlı Cabernet Sauvignon yapraklarındaki enfeksiyonun ifadesinde 25 artan asma transkripti tanımlanmıĢtır. Tanımlanan transkriptler arasında, lösin açısından zengin tekrar eden serin/treonin kinaz benzeri reseptör, bir MYB transkripsiyon faktörü ve hücre içi sinyal iletiminin ve düzenleyici fonksiyonların uyarılmasını gösteren iki ubiquitinasyona bağlı protein tanımlanmıĢtır.

Metalotiyoininler, bir deoksiribonükleaz, bir aspartil proteaz ve bir subtilaz benzeri serin proteaz da dahil olmak üzere yaĢlanma süreçlerinin karakteristik genlerinin sayısı da tanımlanmıĢtır.

Asma kalıtsal bağıĢıklık için genetik kaynakları belirlemek ve odunsu çok yıllık bitkide patojen savunma yolaklarını anlamak için, Gao vd. (2010)‘nin yaptığı çalıĢmada, Arabidopsis thaliana savunma regülatörü EDS1 ortologları araĢtırılmıĢtır. EDS1 benzeri gen ailesi asmada geniĢ bir yer tutar ve daha önce bu ailenin üyeleri, Vitis aestivalis‘in dirençli çeĢidi "Norton"da ifadesi arttığında, duyarlı Vitis vinifera çeĢidi ‗Cabernet Sauvignon‘da asma külleme etmeni Erysiphe necator tarafından uyarılmıĢtır. Asmada külleme ve Salisilik aside EDS1 benzeri genlerin yanıtı belirlenmiĢtir ve EDS1 benzeri

paralogların "Cabernet Sauvignon"da farklı Ģekilde düzenlendiği ve iki tanesinin de

"Norton" da yapısal olarak düzenlendiği tespit edilmiĢtir. VvEDS1 ve VaEDS1 cDNA‘sının ve genomik klonlarının sekansı, protein kodlama sekansında yüksek koruma ve iki asma çeĢitinde promotor sekansının bazı farklılıklarını ortaya koymuĢtur.

Arabidopsis eds1-1 mutantının tamamlanması, asma çeĢitlerinden AtEDS1‘e en yüksek amino asit sekans benzerliği ile EDS1 benzeri gen AtEDS1‘in iĢlevsel bir ortoloğu olduğunu göstermiĢtir. Analizlerde küllemeye duyarlılığın, dirençli ‗Norton‘ ile hassas

‘Cabernet Sauvignon’ arasındaki EDS1 fonksiyonundaki farklılıklar değil, EDS1 ifadesindeki farklılıklar ile iliĢkili olduğunu göstermektedir.

Li vd. (2010), Erysiphe necator‘a dayanıklı Çin yabani Vitis pseudoreticulata W. T.

Wang ‗Baihe-35-1‘ den iki WRKY geni izole etmiĢlerdir ve VpWRKY1 (GenBank accession no. GQ884198) ve VpWRKY2 (GenBank accession no. GU565706) olarak adlandırılmıĢtır. Soğan epidermal hücrelerinde iki proteinin nükleer lokalizasyonu gösterilirken, transaktivasyon fonksiyonu ‗Baihe-35-1‘ yapraklarıyla doğrulanmıĢtır.

VpWRKY1 ve VpWRKY2 ifadesi, ‗Baihe-35-1‘ de Salisilik asit uygulaması ile hızla uyarılmıĢtır. VpWRKY1 ve VpWRKY2 ifadesi ayrıca 11 asma genotipinde Erysiphe necator enfeksiyonu ile uyarılmıĢtır; VpWRKY1‘in yüksek derecede uyarılması, Erysiphe necator‘a dirençli asma genotiplerinde, Erysiphe necator inokülasyon sonrası duyarlı olanlardan daha fazla bulunmuĢtur. Dahası, Arabidopsis‘teki VpWRKY1 veya VpWRKY2‘nin ektopik ifadesi, külleme Erysiphe cichoracearum‘a karĢı direnci arttırmıĢtır ve transgenik bitkilerin tuz toleransını arttırmıĢtır. VpWRKY2, transgenik bitkilerin soğuk toleransını da arttırmıĢtır. Buna ek olarak, iki proteinin Arabidopsis ve asma da bazı savunma marker genlerinin ifadesini düzenlediği gösterilmiĢtir. Veriler, VpWRKY1 ve VpWRKY2‘nin Erysiphe necator‘a karĢı transgenik asma direncinin temelini oluĢturduğunu ve tuz ve soğuk streslerine karĢı toleransa sahip olabileceğini düĢündürmektedir.

Xu vd. (2010)‘nin, yeni bir PR10 geni (VpPR10 olarak adlandırıldı), Çin yabani Vitis pseudoreticulata W. T. Wang Baihe-35-1‘den izole edilmiĢtir. Quantitative Real-time PCR analizi, doğal ortam koĢullarında Erysiphe necator ile inokülasyondan sonra farklı zamanlarda VpPR10‘un transkript seviyesinin değiĢtiğini göstermektedir. VpPR10

ifadesi 24 saat sonra azalmaya baĢlamıĢtır ve 72 saat sonra en düĢük seviyeye ulaĢmıĢtır. Daha sonra artmaya baĢlamıĢtır ve 96 saat sonra normal seviyeye ulaĢmıĢtır.

STS kodlayan gen, birçok biyokimyasal ve fizyolojik olayda merkezi bir rol oynar ve metabolit resveratrolü patojenlere karĢı geniĢ spektrumlu direncin yanı sıra, çeĢitli farmakolojik özelliklere, özellikle bir anti-kanser etkisine sahiptir. Xu vd. (2011)‘nin, külleme dirençli Çin yabani Vitis pseudoreticulata‘tan STS kodlayan genin ifade analizi ve promotor fonksiyonu çalıĢılmıĢtır ve bu iki külleme duyarlı asma (Vitis vinifera L.

Carignane ve Thompson Seedless) ile karĢılaĢtırılmıĢtır. Vitis pseudoreticulata‘da kültüre alınan türlerde belirgin olarak farklı olan STS sıra dıĢı bir ifade Ģablonunu göstermiĢtir. Bu bulgular, dirençli bir asmada STS ifadesinin düzenleniĢinin daha iyi anlaĢılmasını ve bitki hastalıklarına karĢı direncin genetik ıslahını sağlamakta yararlı bilgiler vermektedir.

Vitis pseudoreticulata glyoxal oxidase (VpGLOX), asma külleme etmeni ile enfeksiyona yanıt olarak ifadesi artan genler için Çin yabani Vitis pseudoreticulata

"Baihe-35-1" ten daha önce izole edilmiĢtir. Guan vd. (2011)‘nin yaptığı çalıĢmada ise, Agrobacterium aracılı geçici ifade kullanılarak, küllemeye karĢı savunma için VpGLOX‘ın olası bir fonksiyonu araĢtırılmıĢtır. VpGLOX küllemeye duyarlı ("6-12-2") ve küllemeye dirençli ("6-12-6") bitkilerdeki yapraklarda geçici olarak aĢırı ifade bulmuĢtur. Erysiphe necator ile enfekte edildiğinde, agro-infiltrasyonlanmıĢ yaprakların ve duyarlı ve dirençli genotiplerin her ikisinin kontrol grupları arasındaki hifal geliĢimine iliĢkin açık farklılıklar gözlemlenmiĢtir. VpGLOX‘ın ifadesi, her iki genotipte Real-time PCR ile gözlenmiĢtir. Duyarlı konukçuda ("6-12-2") ifade yalnızca transfekte yapraklarda artmıĢtır ve geçici olduğu görülmüĢtür. Dirençli konukçuda ("6-12-6") transfekte yapraklarda ikinci bir pik görülmüĢtür, muhtemelen bu endojen VpGLOX‘un yanıtını göstermektedir. Veriler, VpGLOX‘un Erysiphe necator‘a direnç kazandırmaya yetebileceğini göstermektedir.

Asmanın doğal savunma mekanizmalarını incelemek, patojen direncini tetiklemek için bitki sinyal yolaklarının uyarılmasına dayanan yeni koruma stratejilerinin geliĢtirilmesi gereklidir. Salisilik asit (SA) yolağının iyi karakterize edilmiĢ ve anahtar bir sinyal

elemanı olan Arabidopsis thaliana NPR1‘e (PR1 geninin ifade olmayanı) benzer iki transkripsiyonel aktifleĢtiricisi (VvNPR1.1 ve VvNPR1.2) birlikte son zamanlarda Vitis vinifera L.‘den izole edilmiĢtir. Henanff vd. (2011), Arabidopsis npr1 mutantının tamamlanması da dahil olmak üzere VvNPR1.1 ve VvNPR1.2‘nin fonksiyonel karakterizasyonu, VvNPR1.1‘in AtNPR1‘in iĢlevsel bir ortologu olduğunu, buna karĢılık VvNPR1.2‘nin muhtemelen farklı bir iĢleve sahip olduğunu ortaya koymuĢtur.

Arabidopsis npr1-2 mutantında VvNPR1.1‘in ektopik aĢırı ifadesi, yüksek SA konsantrasyonunda bitki büyümesini, SA uygulama sonrası PR1 gen ifadesini veya bakteriyel inokülasyonu ve virülans Pseudomonas syringae pv. maculicola bakterilerine karĢı direnci sağlamıĢtır. Ayrıca, Vitis vinifera L.‘de VvNPR1.1-GFP‘nin dengeli Ģekilde aĢırı ifadesi, füzyon proteininin yapıcı nükleer lokalizasyonu ile sonuçlanmıĢtır ve enfekte olmamıĢ bitkilerde PR gen ifadesini arttırmıĢtır. Asma bitkilerde VvNPR1.1-GFP‘nin aĢırı ifadesi, külleme enfeksiyonuna karĢı geliĢtirilmiĢ bir direnç sergilemiĢtir.

Bu çalıĢma, Vitis vinifera L.‘deki biyotrofik patojenlere karĢı direnç için SA/NPR1 sinyal yolağının korunmasının önemini vurgulamaktadır.

Yüksek ökaryotlarda korunmuĢ bir gen ailesi olan retinoblastoma ile iliĢkili (RBR) genler, hücre farklılaĢması, geliĢimi ve memeli hücre ölümünde önemli roller oynamaktadır; bununla birlikte bitkilerdeki iĢlevlerinin azlığı bilinmektedir. Wen vd.

(2012a)‘nin yaptığı bu çalıĢmada, Çin yabani asması Vitis pseudoreticulata W. T. Wang klonu "Baihe-35-1"den bir RBR geni izole edilmiĢtir ve VpRBR olarak adlandırılmıĢtır.

Ġfade analizi sonucu, VpRBR‘nın yaprakta, gövdede, sülüklerde, çiçekte ve tanede farklı ifade seviyeleri gösterdiği bulunmuĢtur. qRT-PCR (quantitative Reverse Transcription PCR) verileri, VpRBR seviyelerinin Çin yabani Vitis pseudoreticulata’nın iki dirençli klonu Erysiphe necator uygulanmıĢ "Baihe-35-1" ve "Baihe-13-1"in Vitis pseudoreticulata‘nın duyarlı bir klonu olan Erysiphe necator uygulanmıĢ "Hunan-1"dan daha yüksek olduğunu göstermiĢtir. Ayrıca asma yapraklarında Salisilik asit (SA), Metil jasmonat (MeJA) ve Etilen (Et)‘e yanıt olarak VpRBR ifadesi de araĢtırılmıĢtır. Birlikte ele alındığında, bu veriler VpRBR‘nin asmadaki külleme direncinin bir yönüne katkıda bulunabileceğini göstermektedir.

Gao vd. (2012)‘nin, Çin yabani Vitis quinquangularis’teki Erysiphe necator‘a duyarlı genlerin karakterizasyonu yapılmıĢtır. Bu çalıĢmadan seçilen 13 genin qRT-PCR ile ifade analizi, dirençli materyal "Shang-24"de Erysiphe necator‘a duyarlı Vitis pseudoreticulata klonu "Hunan-1"den daha hızlı ve yoğun Ģekilde indüklendiğini ortaya koymuĢtur.

Stilbenler gibi bitki sekonder metabolitleri, fungusidal (fungus için ölümcül olan maddeler) potansiyele sahiptir ve birçok bitki türünde bulunur. Resveratrol ve pterostilben gibi asmadaki stilbenler dikkat çekmektedir ve sadece bitkinin patojen saldırısına karĢı savunmasına yardımcı olmakla kalmayıp, aynı zamanda fungusit, anti-inflamatuar ilaçlar, antioksidan ve anti-enfektif ajanlar olarak da kullanılmaktadırlar. Xu vd. (2012), VpROMT olarak adlandırılan resveratrol O-metil transferaz geninin bir adayı, küllemeye dirençli Çin yabani Vitis pseudoreticulata ‗Baihe-35-1‘den izole edilmiĢtir ve karakterizasyon çalıĢmaları gerçekleĢtirilmiĢtir. Ġfade çalıĢmaları, VpROMT‘nin geliĢmekte olan köklerde ifade edildiğini, ancak bitkiler zorlanmadığında yapraklarda, köklerde ve de sülüklerde bulunmadığını göstermiĢtir. qRT-PCR‘nin sonuçları, Vitis pseudoreticulata‘da Erysiphe necator tarafından ve Vitis romanetii‘nin süspansiyon kültür hücrelerinde Metil jasmonat, UV ıĢını ile VpROMT‘nin uyarıldığını göstermiĢtir. Ġfade seviyesi, UV-B uygulamasında baĢarısız iken, MeJA ve UV-C uygulamasının VpROMT geninin ifadesini belirgin bir Ģekilde artırarak asmanın farklı dokularında gösterilmiĢtir. VpROMT ve asma stilben sintaz (VpSTS) geninin birlikte ifadesi, tütün yapraklarında (Nicotiana tabacum) pterostilbenin birikimini sağlamıĢ ve VpROMT‘ı aĢırı ifade transgenik tütün bitkilerinde resveratrol‘den pterostilbenin biyosentezini katalize edebildiği gösterilmiĢtir.

Aldehid dehidrogenazlar (ALDHs), karboksilik asitlere karĢılık gelen reaktif aldehitlerin geri dönüĢümsüz oksidasyonunu katalize eder. Proteinler çeĢitli organizmalarda ve bitkilerdeki farklı büyüme evrelerinde incelense de patojen enfeksiyonundaki potansiyel rolleri incelenmemiĢtir. Wen vd. (2012b)‘nin çalıĢmasında, Çin yabani asması Vitis pseudoreticulata Baihe-35-1‘den patojen ile uyarılabilen bir ALDH geni (VpALDH2B4) izole edilmiĢtir ve fonksiyonel olarak karakterize edilmiĢtir. Arabidopsis yapraklarında geçici olarak ifade edildiğinde,

VpALDH2B4‘in mitokondride bulunduğu görülmüĢtür. Arabidopsis‘de VpALDH2B4‘ün aĢırı ifadesi, hücre ölümü ile sonuçlanmıĢtır, muhtemelen SA sinyal yolağı vasıtasıyla mildiyö ve küllemeye karĢı direnç artıĢı ile sonuçlanmıĢtır. Aynı Arabidopsis transgenik bitkilerinde, tuz stresine karĢı tolerans artmıĢtır; buna, daha az MDA birikimi ve strese duyarlı süperoksit dismutaz aktivitesinin artan ifadesi eĢlik etmiĢtir. Elde edilen sonuçlar, VpALDH2B4 ve belki de ortolog genlerinin, hem biyotrofik patojenler hem de yüksek tuzluluk koĢulları altında strese yanıt verebileceğini göstermektedir.

TIFY gen ailesi, geniĢ bir fonksiyon yelpazesine sahip bir bitki-spesifik gen grubunu içerir. Bu aile ZML, TIFY, PPD ve Jasmonate Zım-Domain (JAZ) proteinleri de dahil olmak üzere dört alt protein grubunu kodlar. JAZ proteinleri SCF^COI1kompleksinin hedefleri olup JA sinyal yolağında negatif düzenleyiciler olarak iĢlev görürler. Son zamanlarda TIFY genlerinin ve özellikle JAZ genlerinin böcek beslemesinde, yaralanmada, patojenlere ve abiyotik strese karĢı bitki savunmasında yer alabileceği bildirildi. Zhang vd. (2012), Vitis vinifera L. genomunda toplam iki TIFY, dört ZML, iki PPD ve 11 JAZ geni tespit etmiĢlerdir. Mikroarray analizleri ve quantitative Real-time RT-PCR ifadesi verileri, asma TIFY genlerinin biyotrofik patojenlere ve virüslere

Belgede ANKARA ÜNĠVERSĠTESĠ FEN BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ DOKTORA TEZĠ (sayfa 34-0)