Musa b. Meymun’un Hayatı

A solubilização das proteínas recombinantes somente foi atingida em tampão contendo 8 M de ureia, condição que mantém as proteínas desnaturadas. Portanto, foram testadas duas

estratégias para a renaturação das proteínas recombinantes: diálise gradual e altas pressões hidrostáticas.

3.16.1. Diálise gradual

A diálise gradual foi realizada para testar a renaturação das proteínas recombinantes em solução com 8 M de ureia, através da diminuição gradual da concentração de ureia na solução.

Como mencionado no item 3.15 desta seção, 10 ml foram separados do sobrenadante das amostras em 8 M de ureia, os quais foram diluídos para um total de 50 ml. Para a diálise, cada amostra foi dividida em dois sacos de diálise (SnakeSkin Dialysis Tubing, 7000 MWCO; Life Technologies®), os quais foram inicialmente submersos em 1 L de tampão para diálise contendo 6 M de ureia (50 mM Tris-HCl pH 6,8 ou 7,4, 500 mM NaCl, 1% Glicina e 6 M de ureia). As diálises foram incubadas a 4°C e as soluções eram continuamente homogeneizadas com o uso de agitadores magnéticos. Após a incubação de aproximadamente 5 horas, os tampões resultantes foram substituídos por tampão contendo 4 M de ureia e as diálises foram incubadas sob as mesmas condições, por ~16 h. Os tampões das diálises foram substituídos por mais duas vezes: primeiramente pelo tampão contendo 2 M de ureia durante aproximadamente 5 horas e, em seguida, as amostras foram incubadas com tampão sem ureia e 0,1% de Glicina, por ~16 h.

Após a diálise, o conteúdo de cada amostra foi centrifugado a 10.000 rpm por 15 min a 4°C (Eppendorf® Centrifuge 5810 R, rotor F-34-6-38). Os sobrenadantes foram transferidos para novos tubos e os precipitados foram ressuspensos em 20 ml de tampão com 8 M de ureia (50 mM Tris-HCl pH 6,8 ou 7,4, 500 mM NaCl, 5 mM -mercaptoetanol e 8 M de ureia). Alíquotas de cada amostra foram preparadas para análise por SDS-PAGE.

3.16.2. Renaturação por altas pressões hidrostáticas

Outra estratégia para a renaturação das proteínas foi a utilização de altas pressões hidrostáticas, a qual foi realizada no Centro de Biotecnologia do IPEN (Instituto de Pesquisa Energéticas e Nucleares), com o auxílio da Dra. Ligia Ely Morganti Ferreira Dias e de sua equipe. A técnica consiste na dissociação e renaturação de proteínas em agregados através da alta pressão aplicada nas amostras que promove a hidratação de resíduos hidrofóbicos e carregados presentes nas proteínas, diminuindo o volume do sistema e desfavorecendo as interações hidrofóbicas e eletrostáticas intermoleculares (LEE et al., 2006). Agentes caotrópicos como hidrocloreto de guanidina, e sistemas redox como o da glutationa reduzida e oxidada (GSH/GSSG), podem ser acrescentados às amostras para romper as pontes de hidrogênio e rearranjar pontes dissulfeto não nativas em nativas, respectivamente.

As amostras utilizadas para a renaturação por altas pressões hidrostáticas consistiam em corpúsculos de inclusão contendo as proteínas recombinantes de interesse. Para a preparação dos corpúsculos de inclusão, os clones selecionados das construções em pAE foram amplificados a partir do estoque em glicerol nas cepas BL21 SI ou BL21 (DE3)-Star pLysS. Culturas de 0,5-2 L foram preparadas e induzidas como descrito no item 3.15 desta seção. Os precipitados celulares de cada cultura foram ressuspensos em 50-100 ml de tampão A1 (100 mM Tris-HCl pH 7,4 e 5 mM EDTA) e, em seguida, foram incubados com 50 µg/ml de lisozima durante 15 min a T.A.. Após a adição de 0,1% de deoxicolato de sódio, as amostras foram submetidas à lise mecânica por 3-4 vezes, sob pressão de 1000-1300 bar (PandaPLUS 2000 Homogeneizer; GEA Niro Soavi®). As amostras homogeneizadas foram centrifugadas a 8.500 rpm por 10 min a 4°C (Eppendorf® Centrifuge 5810 R, rotor F-34-6- 38); os sobrenadantes foram armazenados e os precipitados foram ressuspensos em 50 ml do tampão A2 (100 mM Tris-HCl pH 7,4, 5 mM EDTA e 0,1% deoxicolato de sódio). Após uma rápida sonicação para desfazer os grumos, as amostras foram centrifugadas a 8.500 rpm por

10 min a 4°C; os sobrenadantes foram armazenados e os precipitados foram lavados mais uma vez com o tampão A2. Os precipitados resultantes foram lavados com 50 ml do tampão A3 (100 mM Tris-HCl pH 7,4 e 1 mM EDTA) e os precipitados finais contendo os corpúsculos de inclusão foram ressuspensos em 10 ml de tampão A3, sendo posteriormente distribuídos em alíquotas de 1 ml, submetidos à medição da DO350nm e armazenados a -20°C.

Um teste foi realizado para comparar a renaturação das proteínas em seis condições distintas. As suspensões com os corpúsculos de inclusão foram diluídas em tampão Tris- EDTA (50 mM Tris-HCl pH 8,0 e 1 mM EDTA) para uma DO350nm igual a 1 e a presença ou

ausência de 5 mM GSH/GSSG (1:1), 500 mM L-arginina pH 11,0 e/ou 1 M hidrocloreto de guanidina (Gdn-HCl) foram testadas, segundo a Tabela 5. As amostras em cada condição foram aplicadas separadamente em pequenas bolsas plásticas seladas por calor, as quais foram colocadas em uma bolsa plástica maior selada a vácuo. Posteriormente, as bolsas foram imersas em óleo, usado como um fluido transmissor de pressão, no recipiente do equipamento de alta pressão (R4-6-40, High-Pressure Equipment Company®) (RODRIGUES et al., 2014); as amostras foram submetidas a uma pressão de 2,5 kbar, por ~16 h. Após a incubação sob pressão, o conteúdo de cada bolsa plástica foi centrifugado a 12000 rpm por 15 min a 4°C (Eppendorf® Centrifuge 5415 R, rotor F45-24-11). Os precipitados resultantes foram ressuspensos no mesmo volume de tampão 8 M de ureia (50 mM Tris-HCl pH 6,8 ou 7,4, 500 mM NaCl, 5 mM -mercaptoetanol e 8 M de ureia) e os sobrenadantes foram preparados para diálise em tubos de mini diálise (Slide-A-Lyzer MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 2 ml; Life Technologies®) ou em sacos de diálise (SnakeSkin Dialysis Tubing, 10K MWCO; Life Technologies®). Para as diálises, foi utilizado o tampão 50 mM Tris-HCl pH 8,8 e as amostras foram mantidas em homogeneização constante a 4°C. Primeiramente as amostras foram incubadas por ~16 h e, em seguida, os tampões foram trocados antes de uma segunda incubação por 3-4 horas. Após as diálises, as amostras foram centrifugadas novamente e, em

seguida, os sobrenadantes foram transferidos para novos tubos e os precipitados resultantes foram ressuspensos em 100 µl de tampão 8 M de ureia. Finalmente, alíquotas de cada amostra foram analisadas por SDS-PAGE.

Tabela 5

Comparação da composição das seis condições testadas para testar a renaturação de proteínas recombinantes por altas pressões hidrostáticas.

Reagentes utilizados Condições testadas 1 2 3 4 5 6 Amostra = DO350nm 1 = DO350nm 1 = DO350nm 1 = DO350nm 1 = DO350nm 1 = DO350nm 1 Tris-EDTA pH 8,0 50 mM 50 mM 50 mM 50 mM 50 mM 50 mM L-arginina pH 11,0 --- --- 500 mM 500 mM --- --- Gdn-HCl --- --- --- --- 1 M 1 M GSH/GSSG --- 5 mM (1:1) --- 5 mM (1:1) --- 5 mM (1:1)