Moleküler Çalışmalar

2.2.3.1. SDS-PAGE (Sodyum Dodesil Sülfat – Poliakrilamid Jel Elektroforezi) ile Protein Yapılarının Kıyaslanması

Bu yöntemde proteinler SDS varlığında jel üzerinde yürütülürler. Herbir protein ve proteinlerin alt ünitelerini jel üzerinde tek bant oluşturacak şekilde ayırt etmek mümkündür.

Örümceklerin beslenme süreleri değişmekle birlikte örümcek mide muhtevasının içeriğinde böceğe ait proteinlerin bulunması için beslenmenin başlangıcından itibaren en az 1 saat geçmesi gerekmektedir. Ancak optimum gözlem için beslenmeden itibaren 4 ilâ 12 saat geçmelidir. Av-avcı proteinlerinin kıyaslanması için öncelikli olarak zararlı böcek ve onun üzerinden beslenen örümceğin protein yapıları ayrı ayrı ekstrakte edilmiştir. Numuneler mekanik olarak parçalandıktan sonra, buz üzerinde soğutulmuş lisiz tamponla 30 dakika muamele edilmiştir. Sonra 14.000 g’de 20 dakika +4 ºC’de santrifüjlenerek süpernatantı alınmış ve ayrı ayrı kuyucuklara yüklenmiştir.

Standardizasyonu sağlamak ve dolayısıyla mukayese yapabilmek için her bir kuyucuğa eşit miktarda protein içermek üzere örnekler yükleneceğinden ekstraksiyonlardaki protein miktarı, Bradford yöntemi kullanılarak tespit edilmiştir⁽¹⁸⁸⁾. Spektrofotometrik verilerle protein miktarı hesaplanmıştır.

Elde edilen protein ekstraktları, SDS-PAGE’de % 4’lük yığma jeli ve % 10’luk ayırma jeli kullanılarak yürütülmüştür⁽¹⁸⁹⁾. Her bir kuyucuğa eşit miktarda protein içerecek şekilde ayarlanan av ile avcıya ait ekstrakte edilmiş 2 μl protein örnekleri ile molekül ağırlığı bilinen (10-250 kDa) standart proteinler (Fermentas Chem. Co.)

yüklenmiş ve vertikal mini jelde (Maxigel) sırasıyla 25 ve 30 mA’de 2 saat süreyle elektroforez işlemine tabi tutulmuştur. Ardından jel, gümüş nitrat ile boyandıktan sonra görüntüleme cihazı ile fotografı çekilmiştir. Gümüş nitrat, 10 ng protein miktarına kadar duyarlıdır ve diğer yöntemlere göre daha hassas bir boyama sağlar⁽¹⁹⁰⁾.

Gümüş boyama birçok basamaktan oluşan bir metotdur. Jel ilk önce 30 dakika gümüş boyama fiksatif solüsyonunda, daha sonra sensitizing (oksidatör) solüsyonunda bekletilir. Distile suda 5 er dakika 3-4 değiştirme yaparak yıkanır.

Gümüş nitrat içeren boya solüsyonu içinde 20 dakika boyamaya bırakılır. Boya solüsyonundan çıkartılan jel distile su ile 1-2 dakika yıkanır ve hemen jel developer (geliştirme) içinde 3-5 dakika bantlar görünür hale gelene kadar bekletilir. Protein bantları net görünür hale geldiğinde boyamayı sonlandırmak için jel 10 dakika sonlandırma solüsyonunda bekletilir. Sonlandırma solüsyonunda çıkarılan jel 3 değiştirme yapmak süretiyle 5’er dakika distile su ile yıkanır.

Molekül ağırlıkları hesaplanacak olan protein bantlarının Rf (oransal hız) değerleri, standart proteinlerin Rf değerleri kullanılarak Excel programı yardımıyla çizilen yarı logaritmik grafiğin kalibrasyon eğrisi aracılığı ile hesaplanmıştır.

SDS-PAGE için kullanılan stok çözeltiler ve hazırlanışları EK-2’de gösterilmiştir.

2.2.3.2. PCR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) Yöntemi İle Beslenme İlişkilerinin Tayini

Bu yöntemde yapay oligonükleotidler kullanılarak in vitro olarak hedef bölgenin çoğaltılması gerçekleştirilmiştir⁽¹⁹¹⁾. Bu işlem için öncelikle avcının (tarlaya özgü ve

zararlı üzerinden beslendiği laboratuvarda gözlenmiş olan agrobiyont örümcek) DNA’sı izole edilmiştir.

İzolasyon öncesinde avcı örümcek 36 saat süreyle aç bırakıldıktan sonra avı ile bir araya getirilmiştir. Beslenme süreleri değişmekle birlikte örümcek mide muhtevasının içeriğinde böceğe ait DNA kalıntılarının saptanması için beslenmenin başlangıcından itibaren en az 1 saat geçmesi gerekmektedir. Ancak optimum gözlem için beslenmeden itibaren 4 ilâ 12 saat geçmelidir⁽¹⁴⁷⁾.

Örümceğin sindirim organları hem cephalothorax hem de abdomen içerisine dağılmış olduğundan bacakları uzaklaştırılmış örümcek numunesi post-mortem bağırsak muhtevası analizi için -80 ^◦C’a kaldırılmıştır. Bu aşamadan sonra işleme tabi tutulacak her bir örümcek ve zararlı numunesi sırasıyla 100l ve 500 l’lik bir izolasyon tamponu (TE buffer: 10 mM Tris, pH’ı HCl ile 7.5’a ayarlanır) içerisinde blender yardımıyla homojenize edilmiştir⁽¹⁴⁷⁾. Homojenize edilen numuneler 1.5 ml’lik santrifüj tüplerine yerleştirilmiş ve DNA izolasyonu gerçekleştirilmiştir.

Homojenizat DNA’sı Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit (69504) (Germany) kullanılarak izole edilmiştir. Elde edilen DNA örnekleri -20 °C’da saklanmıştır.

İzolasyon sonrasında ayrımı yapılacak olan ava ait özel primerler kullanılarak PCR işlemine geçilmiştir. Önceden yapılmış çalışmalar dikkate alınarak R. maidis için aşağıda verilen genel tahıl afidi primeri seçilmiştir⁽¹⁴⁷⁾.

Aphid F: 5’ TTTCCGATTAATTGAAGTAG 3’

Aphid R: 5’ ATTCCTGGTCGGTTTTATAAA 3’

PCR koşullarının optimizasyonu için önceden yürütülen çalışmalar göz önüne

hacimde gerçekleştirilmiştir. Bu çözeltide şunlar yer almaktadır: 2.0μl ekstrakte edilmiş DNA, 10×reaksiyon tamponu (100mM Tris-HCl pH 8.3, 500mM KCl, 15mM MgCl2), dNTPs (10mM, hazır stoktan 1.25 mM), 0.4 μM her iki primerden (10mM stoktan), 0.2 u/μl, Taq polimeraz enzimi (5 unit/μL stoktan), MgCl₂ (25 mM stoktan) 2.5 mM ve toplam hacim ddH₂O ile tamamlanmıştır.

Bundan sonra her bir örnek tüpü PCR cihazına (PCP- Thermocycle, Tgradient 96) yerleştirilerek 45 sn 94°C, 45 sn 54°C ve 1 dk 72°C‘lik döngüyle 40 döngüyü içeren bir zincir reaksiyonuna tabi tutulmuştur. Ve reaksiyonun sonunda yükseltgenmenin tamamlanması için 10 dakika 72°C’da bekletilmiştir. Yükseltgenen ürünler jelde yürütülme işlemine kadar 4°C’da saklanmıştır ve bu ürünler % 1.7’lik agaroz jelde 5 V/cm olacak şekilde 1.5-2 saat yürütülerek sonuçlar tartışılmıştır. Gerekli olan agaroz hassas terazide tartılarak 180 ml TBE (Tris Borat EDTA) tamponu içerisine karıştırılarak kaynatılmış ve 50-60°C sıcaklıkta üzerine 0,5 μg/ml etidyum bromit ilâve edilerek ve Agagel Mini marka yatay elektroforez tepsisine dökülüp katılaştıktan sonra tankın içerisine yerleştirilmiştir. TBE tamponu ile iyice doldurulmuş tank içerisine her bir kuyucuğa 5 μl örnek konmuştur. Örnekler yükleme tamponu içerisinde karıştırılarak kuyucuklara yüklenmiştir. Bu tampon 100 ml olacak şekilde (bromfenol mavisi 250 mg, tris pH 7,6 150 mM 33 ml, gliserol 60 ml, dH2O 7 ml) hazırlanmış ve her kuyucuğa amplififikasyon ürünleri ilâve edilmiştir. Ayrıca elde edilen DNA parçalarının kıyaslanması için 100 bç’lik DNA belirleyicisi (Fermentas Chem. Co.) kullanılmıştır. Yürütülen örnekler U.V.

sehpasında incelenerek görüntülenen bantlar polaroid makine ile fotoğraflanmıştır.