Son yıllarda örümcek ve böcekler arasındaki avcı-av ilişkisi SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate – Polyacrylamide Gel Electrophoresis), ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay), PCR (Polymerase Chain Reaction), Poliklonal antikor ve Monoklonal Antikor (mAb) analiz teknikleri ile saptanmış ve örümceklerin ekolojik dengenin korunmasındaki rolleri üzerine araştırmalar giderek yoğunlaşmıştır(123-127).
Örümcek beslenme hızının tayin edilmesinde başı çeken yöntemlerden birisi midede kalan avın tanınması ve miktarının ölçülmesidir(125). Mide muhtevasının açılıp incelenmesi (gut dissection) kolay ve ucuz bir yöntemdir ve bazı omurgasız grupların av spektrumunun tayin edilmesinde sıklıkla kullanılmıştır(128, 129). Örümcekler sıvı besleniciler olduğundan birkaç diyetten kalanların eş zamanlı olarak tayin edilmesi zordur. Mide muhtevasının açılması ve avın tanınması tek başına yeterli olmamaktadır ve bu durum aşılması güç teknik problemler oluşturabilir(130). Bu yüzden mide muhtevası içeriğinin tayininde daha kompleks biyokimyasal ve moleküler tekniklere ihtiyaç duyulmaktadır.
Breene ve ark. (1988) 32F ile işaretlenmiş sivrisinek larvaları üzerinden beslenen örümcekleri radyoaktif çekirdekler yöntemi ile hesaplamışlardır(131). Benzer yöntemin kullanıldığı çalışmalar güve yumurtaları ve larvaları üzerine de yapılmıştır(132,133). Radyoaktif olarak işaretli materyalin çevreye verdiği zararlardan dolayı bu yaklaşımın kullanımı zorluklar arz etmektedir(134). Bunun yanında bazı predatörlerin predatörlük etkinliğinin ve av-avcı arasındaki beslenme etkileşimlerinin analiz edilmesinde kütle spektrometresi ölçümünü kullanan 15N ve 13C kararlı izotopları da kullanılmaktadır(135-138).
Putnam (1967), Kanada şeftali bahçelerinde örümcekler tarafından tüketilen kırmızıörümceklerin pigmentlerini tayin etmek için kağıt kromatografi kullanmış ve bunda başarılı olmuştur(139).
Örümcek mide muhtevasının tayin edilmesinde yaklaşık kırkbeş yıldır etkili bir şekilde kullanılan diğer bir yöntem de omurgalı konaklarda geliştirilen poliklonal veya monoklonal antikorların kullanıldığı serolojik yöntemdir(140). Bu yöntemin en önemli avantajları ucuz olması, basitliği, güvenilirliği, hassas bir yöntem olması ve ergin altı bireylerde bile av spesifikliği sağlaması şeklinde sıralanabilir(92).
Greenstone (1996), çok çeşitli arthropod predatörlerinin diyetini tayin etmek için poliklonal antikorlar kullanmış ve başarılı olmuştur(141). Bu teknik, hedef av proteinlerinin bir memeli içerisine (genellikle bir tavşan) enjekte edilerek antikorların toplanmasını içerir. Benzer iki veya üç enjeksiyondan sonra antikorlar kan serumundan toplanır. Şayet bir beslenme bağı varsa bu antikorlar alandan toplanan avcıların mide muhtevası içerisindeki antijenler üzerindeki epitoplara (bağlanma bölgeleri) bağlanacaktır(142). Bağlanma sonrasındaki izleme farklı yöntemlerle yapılabilir. Çökelti testleri (bir akışkan veya jel arasından geçen antikor ve antijenin birbirlerine pasif olarak difüzyonu) veya immünoelektroforez (elektriksel bir alanda daha hızlı şekilde birbirine bağlanma) kullanıldığında beyaz bir çökeltinin oluşması pozitif olarak ifade edilir(141). Antijen-antikor ilişkisinin aydınlatılmasında ELISA yöntemi kullanıldığında genellikle 96 kuyucukla çalışılır ve antikora direkt veya indirekt olarak bağlanmış bir enzimin aktivitesi araştırılır. Antijenin var olduğu pozitif durumlarda renksiz bir substrat renkli bir ürüne dönmektedir(102,143,144). Benzer şekilde yapılan monoklonal antikor uygulaması da şu an kullanılan en hassas
antikor üreten B-lenfositlerinin birleşmesi sonucunda oluşan hibridoma hücrelerinden elde edilmektedirler. Bu hücreler sürekli olarak üretilebilirler ve bu hücrelerden, seçilmiş herhangi bir monoklonal antikoru sentezlemek üzere tek bir klon izole edilip sürekli olarak çoğaltılabilir. Bu antikorların en önemli avantajı ise elde edilen klonların türe spesifik olmasıdır. Bu klonların sentezlediği antikorlar sadece tek bir epitopa karşı oluşmuştur ve çapraz reaksiyonlara yol açmaz(145). Ayrıca bu yöntemde av yoğunluğu düşük olsa dahi, hedef av dışındaki başka bir avdan da monoklonal antikorlar üretilebilir(146). Uygun bir klonun elde edilmesi için bir yıldan daha fazla bir zamana ihtiyaç duyulması, diğer yöntemlere nazaran daha pahalı bir yöntem olması ve özelleşmiş doku kültürü imkânlarına ihtiyaç duyulması bu yöntemin dezavantajları arasındadır. Sonuçta rastgele başka bir madde de meydana gelebilir ve başarı garantisi yoktur(147). Bunun yanında bir kere elde edildiği zaman çoğaltılması pahalı değildir, ELISA çalışmaları için uygulanması kolaydır ve çok sayıda numunenin hızlı bir şekilde değerlendirilmesinde etkilidir(142).
Amalin ve ark. (2000) bazı yer örümceklerinin turunçgil yaprak galeri güvesi larvaları üzerinden beslenmesini protein elektroforezi kullanarak göstermişlerdir(148). Bu çalışmada indikatör enzim olarak esteraz seçilmiştir çünkü esterazlar çok düşük değerlerde bile olsa substratla birlikte yüksek sönüm katsayısıyla ürün oluşturarak bant vermektedirler(149). Elektroforez yöntemi diğer yöntemlere nazaran daha ucuzdur ve eğer jel - enzim sistemi düzgün bir şekilde optimize edilirse birçok durumda av-avcı ilişkilerinin tayininde çok avantajlıdır. Bu yöntemin en büyük dezavantajı türe özgü ayırıcı bantların yetersizliği veyahutta tek bir predatörün birkaç farklı avla beslendiği durumlarda bantların ayrımının son derece imkânsız olmasıdır(150).
Greenstone ve Edwards (1998) örümcek mide muhtevası içerisindeki avı tayin etmek için türe özgü DNA dizilerinde çalışan problar kullanmışlardır(151). Bu çalışmadan sonra ise av-avcı ilişkilerinin tayininde PCR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) kullanımı dünya gündemine oturmuştur. PCR, arthropod predatörlerin çoğunda mide muhtevasında kalan av kalıntılarının tayininde etkili bir şekilde kullanılmaktadır(126,147,152,153)
. Bu yöntemde predatörlerin mide muhtevası içerisindeki av DNA’sının çoğaltılması için türe veya gruba özgü primerler kullanılır(142). Elde edilen farklı DNA parçaları bandlar şeklinde agaroz jel elektroforezinde izlenmektedir. Bazı av-avcı sistemleri için kullanılan hedef genler, PCR ürünlerinin büyüklüğü, optimum deteksiyon zamanları ve oranları Çizelge 1.6’da gösterilmiştir.
Avcının mide muhtevası içerisindeki avın tayini çevresel ve fizyolojik olarak potansiyel olan birçok faktörden etkilenmektedir(154). Bu yüzden av miktarının tayininde PCR tarafından elde edilen alan verilerinin kullanımı, yorumu etkileyebilecek tüm muhtemel faktörlerin dikkatli bir şekilde değerlendirilmesini gerektirir(155).
Bu faktörlerden biyolojik faktörler; beslenmeden itibaren geçen zaman(147, 153, 156-159)
, cinsiyet(156,158), ağırlık(156), büyüklük, gelişme devreleri, avcının türü(156), avın türü(160,161), öğün büyüklüğü ve sonraki besin alımı(156, 162, 163)
gibi birçok etkiyi içine almaktadır. Sıcaklık ise avlanma miktarını ve dolayısıyla av kalıntılarının tayinini etkileyebilen fiziksel bir faktördür(156). Primerlerin duyarlılığı ve kararlılığı (164,165), çoklu kopya gen dizileri(166), amplifikasyon ürünlerinin büyüklüğü(147,156,162,167), DNA ekstraksiyon yöntemleri ve kalıp DNA’nın miktarı(161,163) ise av DNA’sının tayinini etkileyebilen metodolojik faktörler arasında sıralanabilir.
Çizelge 1.6. Bazı Av-Avcı Sistemleri İçin Kullanılan Hedef Genler, PCR Ürünü Büyüklükleri ve Optimum Deteksiyon Zamanları
Hedef Av Türü Predatör Hedef Genler
PCR ürünlerinin
(Neuroptera: Chrysopidae) COII (mtDNA) 77–386 4 h sonra % 50 pozitif (198 bç) (147) Ostrinia nubilalis
(Lepidoptera: Crambidae)
Coleomegilla maculata
(Coleoptera: Coccinellidae) rRNA (ITS-I) 150–492 10 h sonra % 50 pozitif (150
bç) (156)
Culex quinquefasciatus (Diptera: Culicidae)
Pterostichus cupreus
(Coleoptera: Carabidae) Esteraz genleri 146, 243 28 h sonra % 100 pozitif (146
bç) (166)
Rhopalosiphum maidis (Homoptera: Aphididae)
Oxyopes salticus
(Araneae: Oxyopidae) COII (mtDNA) 198 12 h sonra % 50 pozitif (198
bç) (126)
Cacopsylla pyricola (Homoptera: Psyllidae)
Anthocoris tomentosus
(Heteroptera: Anthocoridae) COI (mtDNA) 188–271 8 h sonra % 100 pozitif (188 ve
271 bç) (168)
(Acarina: Anystidae) COII (mtDNA) 283 48 h sonra % 100 pozitif (283
bç) (169)
Helicoperva spp.
(Lepidoptera: Noctuidae)
Cheiracanthium sp.
(Araneae: Miturgidae) rRNA (ITS-II) 420 8 h sonra % 50 pozitif (420 bç) (170)
*h: half-life time, yarılanma zamanı: diyetin yarısının yenmesi sonrasındaki zaman