MERSİN: KUŞATILMIŞ KENT

Neste estudo foi utilizada a linhagem de macrófagos alveolares de camundongo (AMJ2- C11), obtida do Banco de células do Rio de Janeiro. Estes foram cultivados em garrafas plásticas, em meio DMEM (Sigma) suplementados com soro fetal bovino (SFB) 10% e antibióticos 1%, e mantidos à temperatura de 36,5ºC.

Decorridos 3 a 4 dias, as garrafas de células foram submetidas a tripsinização. Para isso, a monocamada formada foi lavada com PBS 0,05M, pH 7.2 estéril e, após lavagem, este foi desprezado para então acrescentar 2mL de ATV-solução de tripsina 0,2% e EDTA 0,02% (Adolfo Lutz). Seguidos 1-2 minutos, as células foram homogeneizadas com volumes variados do meio DMEM acrescido de SFB e antibióticos. O volume total da suspensão celular obtido foi transferido para outras garrafas, de modo a se obter uma concentração celular de 105 células/mL.

3.5.2. Infecção de macrófagos in vitro por H. capsulatum

A fase leveduriforme de H. capsulatum foi cultivada em meio BHI caldo suplementado com 0,1% de cisteína e 1% de glicose durante 24 horas sob agitação (100 rpm), a 37 ºC.

Os ensaios de infecção foram realizados sobre lamínulas em placas de 24 poços (TPP®, Trasadingen, Switzerland). A monocamada de células foi formada por aproximadamente 24 horas em meio DMEM e de forma a obter 105 células por poço. A infecção celular por H. capsulatum foi realizada com uma suspensão de leveduras padronizada de 1 x 106 – 5 x 106 células/mL conforme descrito no item 3.2.2.

As características particulares da interação após o contato de H. capsulatum com macrófagos foram analisadas por imagens obtidas após coloração por Giemsa, microscopia de fluorescência e confocal. O IN Cell Analyzer 2000 System light microscopy também foi utilizado no estudo dessa interação e, para isso, os núcleos foram corados por DAPI, os filamentos de actina por FITC e H. capsulatum foram detectados com Alexa 594 conjugado com anticorpo. Todos os ensaios foram conduzidos em triplicata.

3.5.2.1. Coloração pelo método de Giemsa

A coloração por Giemsa foi realizada conforme descrito no item 3.2.2.1.

3.5.2.2. Marcação de H. capsulatum na infecção com macrófagos por imunofluorescência A marcação por imunofluorescência foi feita de acordo com o procedimento descrito no item 3.2.2.2. para posterior análise por microscopia de fluorescência, confocal e aquisição de imagens pelo IN Cell Analyzer 2000 System light microscopy.

3.5.2.3. Índice de infecção de H. capsulatum em macrófagos AMJ2-C11 por contagem de UFC/mL

A interação de H. capsulatum com macrófagos AMJ2-C11 também foi avaliada através de uma curva de células leveduriformes aderidas. Foi quantificado o potencial de infecção das cepas EH-335 (ATCC), EH-315 e 60I em macrófagos alveolares AMJ2-C11 nos tempos de 0, 7, 15 e 30 minutos, e também 1, 2, 3 e 5 horas.

Os ensaios foram realizados conforme descrito no item 3.2.2.3. para posterior contagem de UFC/mL e determinação da porcentagem de adesão. Os ensaios foram conduzidos em triplicata, em dois experimentos independentes e os dados foram submetidos à análise estatística usando Origin 7.0 (Origin Lab Corporation, Northampton, MA). Valores de p˂0,05 foram considerados significantes.

3.5.3.1. Preparação das lâminas com agarose ponto de fusão normal

O ensaio do cometa foi realizado conforme descrito por Singh, Mccoy et al. (1988). Inicialmente a agarose foi dissolvida (1,5 g em 100 mL de PBS) em becker. Esta mistura foi fervida em microondas por cerca de 50 segundos e agitada até sua completa dissolução. Em seguida, as lâminas previamente limpas foram mergulhadas na solução de agarose, o excesso foi removido com auxílio de gaze porosa. Foram então colocadas na horizontal em temperatura ambiente para completa solidificação e formação de uma base em gel de agarose sobre a lâmina. As lâminas foram identificadas em sua parte fosca e armazenadas.

3.5.3.2. Preparação da amostra para ensaio do cometa

Foi feito o ensaio de infecção da linhagem celular AMJ2 – C11 com H. capsulatum conforme descrito no item 3.5.2. para o ensaio do cometa. Os testes foram feitos com a cepa EH- 315, cepa 60I e um controle de células normais. Foi selecionado o período de incubação de 5 horas e, após este tempo de infecção o sobrenadante foi removido dos poços e as células foram tripsinizadas com ATV-solução de tripsina 0,2% e Versene 0,02%. Em seguida. O conteúdo dos poços foi transferido para tubo de fundo cônico e centrifugado a 200 rpm por 3 minutos, o sobrenadante foi descartado e foi adicionado solução de Hanks, para retirada completa do meio de cultura. Os tubos foram novamente centrifugados a 200 rpm por 3 minutos e após a retirada do sobrenadante as células foram ressuspensas em 200 μL de agarose low melting point (LMP) e homogeneizadas. 100 μL desta suspensão foram depositados sob uma lâmina previamente preparada com agarose ponto de fusão normal, de maneira que foram feitas duas lâminas para cada amostra. Posteriormente, uma lamínula grande (24x60 mm) foi colocada sobre a lâmina, que foi mantida na geladeira por 5 minutos. Após esse período, as lamínulas foram retiradas cuidadosamente da lâmina, evitando-se, durante todo o processo, exposição direta à luz, que pode ocasionar danos adicionais ao DNA. As lâminas foram então acondicionadas em cubetas, na qual foi adicionada solução de lise previamente refrigerada (4 °C), por um tempo mínimo de incubação de 2 horas, ao abrigo da luz. Após o tempo de lise as lâminas foram retiradas da cubeta e transferidas para a cuba de eletroforese.

3.5.3.3. Eletroforese

As lâminas foram colocadas em uma cuba de eletroforese horizontal de forma a preencher todos os espaços vazios; quando necessário estes espaços foram preenchidos com lâminas limpas. A cuba de eletroforese foi envolvida com gelo para manter a corrida em uma

temperatura de ± 4 °C. A solução de eletroforese foi adicionada suavemente à cuba (pH>13) de maneira a cobrir todas as lâminas com uma fina camada de solução. As lâminas foram mantidas com a solução de eletroforese na cuba por 20 minutos, para permitir a desespiralização do DNA. Após esse tempo teve início a corrida de eletroforese a 25 v. o tempo de corrida foi de 25 minutos. Após a eletroforese as lâminas foram cuidadosamente retiradas da cuba e neutralizadas em solução de neutralização (4 °C) por 15 minutos. Em seguida, as lâminas foram fixadas em etanol puro por 5 minutos.

3.5.3.4. Coloração

Para corar as lâminas foram adicionados 50 μL de brometo de etídio por lâmina, que foi coberta com lamínula grande (24x60mm). A leitura das lâminas foi feita imediatamente após a coloração

3.5.3.5. Análise de dano ao DNA pelo ensaio do cometa

Para visualização dos danos ao DNA, as lâminas foram observadas em microscópio de fluorescência (filtro de excitação de 516-560 nm e filtro de barreira de 590 nm) em aumento de 400 vezes. Esse aumento permitiu a observação de imagens microscópicas com contorno circular (sem danos no DNA) ou núcleo celular fragmentado em forma de “cometa” (com danos no DNA). Foram analisadas 50 células de cada lâmina em teste cego, sendo que cada amostra foi feita em triplicata. As imagens dos nucleóides foram analisadas por software próprio, denominado Tritek CometScore TM versão 1.5 (www.autocomet.com).

3.5.3.6. Análise estatística

Para análise estatística, os resultados foram analisados pelo GraphPad Prism 5.0. A análise de variância Kruskal Wallis com pós-teste de Dunn’s foi utilizada. Um valor de P˂0,05 foi considerado significante.

3.5.4. Método TUNEL

Outra metodologia empregada para avaliação de fragmentação de DNA em macrófagos foi a técnica TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase-dUTP nick end labeling), seguindo-se o protocolo recomendado pelo fabricante (Roche Diagnostics, Germany) que tem como princípio a marcação específica de sequências de DNA da fragmentação que ocorre durante o processo de apoptose celular.

Para tanto, foi realizado o teste de infecção com as cepas EH-315 e 60I de H. capsulatum na fase leveduriforme em macrófagos alveolares (AMJ2-C11) cultivadas em placas de 96 poços. As células foram incubadas com suspensão de H. capsulatum de cada uma das cepas, correspondente a 2,5 x 106 células/mL, pelos períodos de infecção de 30 minutos, 2 e 5 horas, e células não infectadas, foram também analisadas como controle negativo. A seguir, o tapete celular foi lavado com PBS e fixado em paraformaldeído 4% por 1 hora a temperatura ambiente. Após a fixação, as amostras foram lavadas 3 vezes com PBS gelado e foram incubadas com 200μl solução de permeabilização (Tris 0,05M, CaCl2 0,02M e proteinase K 2,5 μg/ml), por 15 minutos a temperatura ambiente. Após nova lavagem com PBS gelado, as lamínulas foram bloqueadas com 200μl de solução de bloqueio composta por soro albumina bovina (BSA) a 3% e soro fetal bovino (SFB) a 20% em PBS, por 1 hora a 37°C. Após este tempo, as lamínulas foram lavadas 3 vezes com PBS gelado e incubadas com a mistura dos componentes do “TUNEL” (solução contendo dUTP conjugado com fluoresceína e enzima “terminal deoxinucleotidil transferase”), por 1 hora a 37oC, em câmara úmida e ao abrigo da luz. Nas células normais utilizadas como controle negativo, não foi adicionada a enzima transferase terminal, para verificação da ligação inespecífica dos nucleotídeos marcados. Durante o período de incubação, na extremidade 3’ dos fragmentos apoptóticos de DNA foram incorporados os nucleotídios marcados com fluoresceína, catalisados pela transferase terminal. Após incubação, foram feitas 3 lavagens com PBS gelado, e em seguida foi adicionado 100 μl de paraformaldeído 1% por poço. A análise de fragmentação do DNA em macrófagos foi feita de forma comparativa entre as duas cepas (EH-315 e 60I), tendo células normais não infectadas como controle negativo. Imagens foram adquiridas utilizando o equipamento IN Cell Analyzer 2000 System light microscopy, a partir das quais foi feita a análise pelo software IN Cell Investigator 1000 Workstation, no qual os resultados foram avaliados utilizando como parâmetro a intensidade da fluorescência emitida pelo núcleo em cada uma das situações.

3.5.4.1. Análise estatística

Para análise estatística, os resultados foram analisados pelo Origin 7.0 (Origin Lab Corporation, Northampton, MA) utilizando o teste ANOVA. Um valor de P˂0,05 foi considerado significante.

4. RESULTADOS