GÖÇ NEDİR ?

Foi utilizada uma linhagem de células epiteliais de pulmão humano, as células A549, caracterizadas como pneumócitos, obtidas do Banco de Células do Rio de Janeiro, para avaliar o

padrão de infecção por H. capsulatum conforme descrito por Mendes-Giannini, Hanna et al. (2004).

As células epiteliais foram cultivadas em meio HAM F-12 (Cultilab) suplementado com 10% de soro fetal bovino (Cultilab) e mantidos a temperatura de 36,5 °C. Decorridos 3 a 4 dias, as garrafas de células foram submetidas à tripsinização. Para isso, a monocamada celular formada foi lavada com 1 mL de ATV-solução de tripsina 0,2% e Versene 0,02% e, após lavagem, esta foi desprezada e acrescentado mais 1 mL de ATV. Seguidos 1-2 minutos, as células foram homogeneizadas com volumes variados do meio HAM F-12, acrescido de 10% de soro fetal bovino (SFB). Nesta etapa, a tripsina foi neutralizada pelo soro fetal bovino presente no meio de cultura e o volume total da suspensão célula foi transferido para outras garrafas, de modo a se obter uma concentração celular de 106 células/mL.

3.4.2. Infecção por H. capsulatum à monocamada de células A549

Os ensaios de infecção foram realizados sobre lamínulas em placas de 24 poços (TPP®, Trasadingen, Switzerland). A monocamada celular foi formada por aproximadamente 24 horas em meio HAM F-12 e de forma a obter 1 x 105 células por poço. Após acertar a concentração do inóculo de leveduras (1 x 106 – 5 x 106 células/mL), a infecção foi realizada. Então, cada poço foi inoculado com 500 μL da suspensão padronizada de H. capsulatum em PBS acrescida de 500 μL de meio HAM F-12. A seguir, as células infectadas foram incubadas a 37 °C, por 30 minutos, 2, 5 e 24 horas. Após período de incubação o sobrenadante foi removido e os poços foram lavados três vezes com PBS. Finalmente, 500 μl de paraformaldeído 4% foram adicionados a cada poço e a placa foi mantida “overnight” a 4 °C. Em seguida, as lamínulas foram lavadas três vezes com PBS e o potencial de infecção do fungo aos pneumócitos foi observado usando imagens obtidas após coloração por Giemsa, microscopia de fluorescência e confocal. Além disso, foram analisadas imagens adquiridas pelo IN Cell Analyzer 2000 System light microscopy, no qual o núcleo das células foi corado com DAPI, os filamentos de actina foram revelados por FITC e leveduras de H. capsulatum foram detectadas por um anticorpo conjugado com Alexa-594. Todos os ensaios foram feitos em triplicata, em dois experimentos independentes. Através das técnicas microscópicas utilizadas foi possível observar o padrão de infecção de cada uma das cepas às células epiteliais. Além disso, a adesão foi quantificada de forma comparativa para ambas as cepas (EH-315 e 60I) em contato com as células epiteliais A549 em diferentes tempos, através da contagem de UFC/mL.

3.4.2.1. Coloração pelo método de Giemsa

Inicialmente foram adicionados 300 μL de metanol absoluto às lamínulas durante 3 a 5 minutos. Após esse período o metanol foi retirado. As lamínulas foram então cobertas com solução corante Giemsa por 15 minutos. Em seguida foram feitas três lavagens com água destilada e as lamínulas foram retiradas dos poços, uma a uma, com o auxílio de agulha e pinça, e colocadas para secar em papel de filtro. Depois de secas, as lamínulas foram colocadas em uma lâmina com uma pequena quantidade de bálsamo do Canadá, para fixação. Em seguida, foi feita a observação ao microscópio.

3.4.2.2. Marcação de H. capsulatum às células epiteliais por imunofluorescência

Para a determinação do padrão de infecção de H. capsulatum através de microscopia de fluorescência, confocal e aquisição de imagens pelo IN Cell Analyzer 2000 System light microscopy, as lamínulas foram marcadas por imunofluorescência.

Inicialmente foi feita permeabilização com Triton 0,25-0,5%, durante 30 minutos à temperatura ambiente. Após esse período foram feitas três lavagens com PBS tween (20) 0,05%. Foi realizado bloqueio por 1 hora (37 ºC), seguido da adição do anticorpo anti-Histoplasma (Título 1:4) que foi mantido em contato com a lamínula por 1 hora à temperatura ambiente. Em seguida, foram realizadas três lavagens com PBS tween e então foi adicionado o anticorpo anti- Rabbit IgG conjugado com Alexa 594 (Título 1/250) por 1 hora à temperatura ambiente. Novamente três lavagens foram feitas com PBS tween. Foi adicionado Faloidina 1:50 em Azul de Evans, por 50 minutos, à 37 ºC, seguido de três lavagens com PBS tween. Posteriormente, foi adicionado DAPI 0,5μg/mL, por 10 minutos, à 37 ºC e ao final foram feitas três lavagens com PBS tween. A lamínula foi cuidadosamente colocada em lâmina de vidro para observação em microscópio de fluorescência e confocal. Para análise no IN Cell Analyzer 2000 System light microscopy, as lamínulas marcadas foram mantidas na placa.

3.4.2.3. Índice de adesão às células epiteliais A549 por contagem de UFC/mL

A adesão de H. capsulatum em células epiteliais A549 foi também avaliada através de uma curva de adesão, a fim de estabelecer qual o tempo inicial da adesão da levedura nesta linhagem celular, bem como determinar o tempo no qual ocorre a maior taxa de adesão, padronizando o melhor tempo para o estudo da mesma. Foi avaliada a adesão das cepas EH-335 (ATCC), EH-315 e 60I em células epiteliais A549 nos tempos de 0, 7, 15 e 30 minutos, e também 1, 2, 3 e 5 horas.

O ensaio de adesão foi realizado em placas de 24 poços, contendo 1 x 105 células por poço, conforme Sardi, Duque et al. (2012). Após a formação da monocamada celular nas placas, foram adicionados 500μL de um inóculo de 2,5 x 106

UFC/mL de leveduras. As placas foram incubadas a 37°C, pelos tempos determinados. Após cada tempo de incubação, as células foram lavadas três vezes com PBS estéril e em seguida, foram tripsinizadas e 100μL foram plaqueados em meio BHI suplementado com 0,1% de cisteína e 1% de glicose. Após 24 horas do plaqueamento foram contadas as colônias de leveduras que cresceram nas placas, correspondentes ao número de leveduras aderidas às células. Para o cálculo da porcentagem de adesão, foi considerado que 2,5 x 106 UFC/mL corresponde a 100% de adesão, uma vez que este é o número total de leveduras colocadas em contato com as células.

Dessa forma, foram definidas as curvas correspondentes ao índice de adesão em cada um dos tempos para todas as cepas, sendo que os ensaios foram conduzidos em triplicata, em dois experimentos independentes e os dados foram submetidos à análise estatística usando Origin 7.0 (Origin Lab Corporation, Northampton, MA). Valores de p˂0,05 foram considerados significantes.

3.5. Ensaios de interação entre Macrófagos (AMJ2 – C11) e H. capsulatum