Bu araştırma, Selçuk Üniversitesi Deneysel Tıp Araştırma ve Uygulama Merkezi Deney Hayvanları Etik Kurulundan alınan onayla (2009/52) gerçekleştirilmiştir. Çalışma, aynı merkezden temin edilen 32 adet erkek Wistar albino rat üzerinde yürütülmüştür. Merkezden temin edilen ratlar özel besleme kafesleri içinde standart rat yemi ve su ile beslenmiştir. Ratlar, araştırma boyunca standart koşullara sahip (20 ±2 ºC oda sıcaklığı, %50 ±5 nispi nem, 12 saat aydınlık ve 12 saat karanlık periyodunda) laboratuvar ortamında barındırılmışlardır. Deneysel çalışmalar ise Selçuk Üniversitesi Veteriner Fakültesi Histoloji-Embriyoloji Ana Bilim Dalı ve Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü Sitoloji-Histoloji Araştırma Laboratuvarlarında gerçekleştirilmiştir.
3.1. Deney Grupları
Bu çalışmada, ortalama 50 g ağırlığındaki 20 günlük 32 adet erkek Wistar albino rat kullanılmıştır. Çalışma başlangıcında ratlar kontrol (n=16) ve nifedipin (n=16) grubu olmak üzere iki gruba ayrılmıştır. Çalışmada kullanılan kontrol grubu ratlar deney süresince sadece standart rat yemi ve su ile beslenmiştir. Nifedipin grubuna, ratlarda büyümenin baskılanmasını engellemek için bir hafta süreyle toz formundaki nifedipin (125 mg/kg) her gün standart rat yemine karıştırılarak verilmiştir. Gerekli dozun alınmasını sağlamak amacıyla ratların öncelikle nifedipin içeren yemi tüketmesi sağlanmıştır ve daha sonra günlük yem ihtiyacının kalanı verilmiştir. Ratların klinik durumları her gün kontrol edilmiştir. Đkinci haftadan itibaren üç hafta boyunca her gün nifedipin (250 mg/kg) aynı yöntemle verilmiştir (Mangıroğlu, 2012). Ratlar deney başlangıcında ve deneyin 30 ve 70. günlerinde tartılarak ağırlıkları kaydedilmiştir.
30. gün sonunda her iki gruptan sekizer rat servikal dislokasyon ile ötanazi edilmiş ve doku örnekleri alınmıştır. Kalan 16 rat deneyin 70. gününe kadar sadece standart rat yemi ve su ile beslenmiş, 70. gün sonunda servikal dislokasyon ile ötanazi edilmiş ve doku örnekleri alınmıştır.
Araştırmanın 30. gününde kontrol ve nifedipin gruplarındaki ratların dokularından elde edilen histolojik ve histometrik veriler araştırma sonuçları bölümünde sırasıyla kontrol 30 grubu ve nifedipin 30 grubu başlığı altında, araştırmanın 70. gününde kontrol ve nifedipin gruplarındaki ratların dokularından elde edilen veriler ise sırasıyla kotnrol 70 grubu ve nifedipin 70 grubu başlığı altında verilmiştir.
3.2. Dokuların Alınması
Nifedipinin uygulandığı ilk gün deneyin 0. günü olarak kabul edilmiştir. 30 ve 70. gün sonunda kontrol ve nifedipin gruplarındaki ratlardan alınan karaciğer ve ince bağırsağa ait doku örnekleri %10’luk nötr formalin solüsyonunda tespit edilmiştir.
3.3. Dokuların Takibi
Tespit işlemi sonunda dokular histolojik doku takip kasetlerine yerleştirilerek akan musluk suyu altında yıkanmaya alınmıştır. Tespit sıvısı, dokulardan uzaklaştırıldıktan sonra dokular yükselen etil alkol serilerinden geçirilerek dehidre edilmiştir. Dehidratasyon işleminden sonra dokular şeffaflaştırıcı olarak kullanılan ksilen serisinde tutulmuştur. Ksilen+parafin işlemini takiben dokular yumuşak parafinde (46-48°C) bekletilmiştir. Daha sonra ise dokular sert parafin (56-58°C) içerisinde bekletilmiş ardından kalıplar yardımıyla sert parafinle doku blokları hazırlanmıştır.
3.4. Kesitlerin Histokimyasal Boyaması
Parafin bloklardaki dokulardan rotary mikrotomla her örnekten 6 µm kalınlığında kesitler alınmış ve boyama işlemine geçilmiştir.
Dokuların genel histolojik yapılarını değerlendirmek ve histometrik analizlerini (villus eni, villus boyu, villus alanı, tunika muskularis tabakasının kalınlığı ve karaciğerdeki dikaryotik hepatosit oranı) gerçekleştirmek amacıyla preparatlara Hematoksilen-Eozin (H-E) ve Crossmon üçlü boyası uygulanmıştır.
H-E boyaması için alınan kesitler deparafinizasyon ve rehidrasyonu takiben 3 dakika Harris’in hematoksileninde tutulmuştur. Asit alkolde ve amonyaklı suda bekletilen dokular, %80’lik alkolü takiben 1 dakika alkol-eozin solüsyonunda bekletilmiştir. Dehidre edilen kesitler ksilen serilerinden geçirilerek sentetik reçine (Entellan, Merck KgaA, Frankfurter Str. 250, 64293 Darmstadt, Germany) ile kapatılmıştır (Culling ve ark., 1985).
Crossmon üçlü boyaması için alınan kesitler ise deparafinizasyon ve rehidrasyonu takiben 10 dakika Weigert’in hematoksileninde tutularak metil karbonatta çalkalanmıştır. 5-25 saniye asit fuksinde tutulan kesitler (bağ doku beyazlayana kadar) fosfotungustik asitte aktarılmış ardından 3 dakika anilin blue ile boyanmış ve %2’lik
asetik asitte bekletilmiştir. Dehidre edilen kesitler ksilen serilerinden geçirilerek Entellan ile kapatılmıştır (Culling ve ark., 1985).
Đnce bağırsaktaki goblet hücrelerinin belirlenmesi için kesitlere PAS (Periodic- Acid Schiff) yöntemi uygulanmıştır (Bancroft ve ark., 1994). PAS yöntemiyle ince bağırsakta nötral musin salgılayan goblet hücreleri demonstre edilmiştir. Bu amaçla, deparafinizasyon ve rehidrasyonu takiben kesitler %0.5’lik periodik asitte 15 dakika ardından ise kesitler 30 dakika Schiff solüsyonunda inkübe edilmiştir. Kesitlere Harris’in hematoksileni 1 dakika süreyle uygulanmıştır. Dehidre edilen kesitler ksilen serilerinden geçirilerek Entellan ile kapatılmıştır.
Karaciğer hücrelerindeki NOR (Nucleolus Organizer Region) parametrelerini belirlemek amacıyla gümüşleme boyama yöntemi (Silver Staining Nucleolus Organizer Region, AgNOR) kullanılmıştır (Platon ve ark., 1986; Korek ve ark., 1991). Bu boyama yönteminde kullanılan jelatin-formik asit solüsyonu; 2 g jelatinin, 100 ml %1’lik formik asit içinde çözdürülmesiyle hazırlanmıştır. Gümüş nitrat çözeltisi ise, 50 g kristal gümüş nitratın 100 ml distile suda çözdürülmesiyle hazırlanmıştır. Boyama solüsyonu, taze hazırlanan ve oda sıcaklığına getirilen jelatin-formik asit solüsyonu ile gümüş nitrat çözeltisinin kullanımdan hemen önce karıştırılmasıyla hazırlanmıştır. Bu amaçla; 1 hacim jelatin-formik asit solüsyonuyla 2 hacim %50’lik gümüş nitrat solüsyonu karıştırılmıştır. Karaciğer dokusuna ait kesitler oda sıcaklığında ve karanlıkta 30 dakika süreyle AgNOR boyama solüsyonunda tutulmuştur. Dehidre edilen kesitler ksilen serilerinden geçirilerek Entellan ile kapatılmıştır.
3.5. Kesitlerin Histometrik Değerlendirilmesi
H-E boyasıyla hazırlanan bağırsak preparatlarında her örnekteki villus enini (en ince ve en kalın iki bölgenin ortalaması), yüksekliğini ve alanını belirlemek için en az 30 villus değerlendirilmiştir. Tunika muskularis tabakasının kalınlığını belirlemek için ise her örnekte en az 50 farklı yerden ölçüm yapılmıştır.
Her örneğin bağırsak epitel katmanında bulunan goblet hücresi sayısı PAS reaksiyonuyla belirlenmiş ve en az 30 villusunda bulunan goblet hücreleri (villusun sağı ve solu) sayılmıştır. Sonuçlar ortalama goblet hücresi sayısı/birim epitel uzunluğu (100 µm) şeklinde hesaplanmıştır.
Hazırlanan karaciğer preparatlarında her örnek için en az 50 hepatosit değerlendirilerek çekirdek alanı ve AgNOR alanı belirlenmiştir. Elde edilen verilerden
AgNOR alanı/Çekirdek alanı oranı (AgNOR alanı x 100/Çekirdek alanı) hesaplanmıştır. AgNOR sayısını belirlemek için ise her örnekte en az 100 hepatosit değerlendirilmiştir. Karaciğer dokularında her örnekte 1,000 hepatosit değerlendirilerek dikaryotik hücre sayısı belirlenmiş ve yüzde olarak verilmiştir.
Hazırlanan preparatlar dijital kameralı ışık mikroskobuyla (Olympus BX-51 Microscope with Olympus DP-71 Digital Camera System) incelenmiş ve gerekli görülen bölgelerin dijital görüntüleri kaydedilmiştir. Görüntüler, dijital görüntü analiz programıyla (DP2-BSW, Olympus corporation, Ver. 1.2, 2006) değerlendirilmiş ve incelenen parametrelerin sayısal verileri elde edilmiştir. Sonuçlar tablolarda ortalama ± standart sapma (
x
±SS) olarak verilmiştir.3.6. Đstatistiksel Analizler
Đstatistiksel analizler için SPSS (Statistical Package for the Social Sciences 13.0 for Windows, SPSS Inc., Chicago 60606, USA) paket programı kullanılmıştır. Elde edilen verilere non-parametrik testler uygulanmıştır. Kontrol 30 grubu ve nifedipin 30 grubu ile kontrol 70 ve nifedipin 70 grupları arasındaki farkların belirlenmesi için Mann-Whitney U testi uygulanmıştır. Kontrol 30 grubu ve kontrol 70 grubu ile nifedipin 30 ve nifedipin 70 grupları arasındaki farkların belirlenmesi için ise bağımlı iki örneklem Wilcoxon testi uygulanmıştır.
4. ARAŞTIRMA SONUÇLARI VE TARTIŞMA