Linoleik Asit Duyarlılığı Belirlenen İzolatların KLA Üretim Kapasitelerinin

Linoleik aside karşı duyarlılığı test edilen T21, K13, Ü23, S11, D12, K32, GS4 kodlu Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii ve ÜP1, S14 kodlu Propionibacterium thoenii izolatlarının 50, 40, 25 ve 10 µg/mL linoleik asit içeren besi yeri ortamında gelişen canlı hücre sayımları bölüm 3.2.3’te anlatıldığı gibi yapılmış ve sonuçlar Şekil 4.2.’de gösterilmiştir.

Şekil 4.2. 10, 25, 40 ve 50 µg/mL linoleik asit içeren YEL besi yerinde gelişen propiyonik asit bakterisi sayılarındaki değişim BLA: Belirlenebilir limitin altında (< 1 log kob/mL) a, b, c: Her bir LA konsantrasyonu için farklı harfler ile gösterilen değerler p<0,05 düzeyinde birbirinden farklıdır.

Propiyonik asit bakterilerinin linoleik asite karşı duyarlı oldukları ve LA varlığında gelişiminin azaldığı veya tamamen durduğu bölüm 4.3.’de bahsedilmişti. Bu bölümde daha düşük konsantrasyonlarda PAB’ların sayımı ve bu oranda linoleik asitten KLA üretim miktarları hesaplanmıştır. Şekil 4.2.’de görüldüğü gibi test edilen en yüksek konsantrasyona (50 µg/mL) K32, GS4 ve ÜP1 kodlu izolatlar direnç göstermiş ve bakteri sayımları sırasıyla 3,32; 3,04 ve 2,08 log kob/mL olarak belirlenmiştir. İzolatlar en yüksek sayıya en düşük konsantrasyonda (10 µg/mL) ulaşmıştır. K32 ve GS4 kodlu P.

freudenreichii subsp. shermanii, 10 ve 25 µg/mL linoleik asit oranlarında sırasıyla

0,00

79

9,89/9,45 ve 9,00/9,34 log kob/mL sayılarına ulaşmıştır. Linoleik asit oranı 10 µg/mL olduğunda K32, GS4, ÜP1 ve S14 kodlu izolatlar istatiksel olarak anlamlı oranda (p<0,05) diğer izolatlardan daha yüksek sayıya ulaşmışlardır.

T21, K13, Ü23, S11, D12 kodlu Propionibacterium freudenreichii subsp.

freudenreichii olarak tanımlanan izolatlar, test edilen her LA oranında K32 ve GS4 kodlu Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii olarak tanımlanan izolatlardan önemli derecede farklı (p<0,05) duyarlılık göstermiştir. Bu sonuçlar bir önceki bölümde bulduğumuz LA duyarlılık testi ile tutarlılık içindedir. Aynı şekilde ÜP1 ve S14 kodlu Propionibacterium thoenii olarak tanımlanan izolatlar da anlamlı olarak 10 ve 25 µg/mL linoleik asit oranlarında Propionibacterium freudenreichii subsp. freudenreichii olarak tanımlanan izolatlardan farklılık göstermiştir.

Bu çalışmanın asıl hedeflerinden biri yüksek KLA üreten propiyonik asit bakterilerini belirlemektir. Çizelge 4.5‘te LA duyarlılığı test edilmiş 9 adet izolatın KLA üretim miktarları gösterilmiştir. Linoleik asit konsantrasyonu 10 µg/mL olduğunda en yüksek KLA üretimi gerçekleştiren izolatlar sırasıyla GS4, K32 ve ÜP1’dir. Aralarında istatiksel olarak anlamlı bir fark yoktur (p>0,05). Linoleik aside duyarlılığı daha yüksek olduğu belirlenen T21 ve K13 ise diğer izolatlara göre istatistiksel olarak önemli derecede düşük verimle KLA üretebilmiştir (p<0,05). Rumende bulunan birçok bakteri türünün doymamış yağ asitlerini, özellikle LA'yı KLA'ya dönüştürdüğü bilinmektedir. Bununla birlikte, konjuge yağ asitlerinin verimi suştan suşa değişmekte bu nedenle bakteri seçimi önem arz etmektedir. Ayrıca, pH, sıcaklık, oksijen ve geliştirme ortamının seçimi de dahil olmak üzere birçok faktörün mikrobiyal üretim sürecini etkilediği bildirilmiştir (Gong vd., 2019). KLA üretimi konusunda özellikle Lactobacillus ve Bifidobacterium ön plana çıksa da Propionibacterium‘un KLA üretimiyle ilgili çok sayıda çalışma mevcuttur (Salsinha, Pimentel, Fontes, Gomes ve Rodríguez-Alcalá, 2018; Angelopoulou vd., 2017; Gorissen vd., 2015; Wang vd., 2007; Auli Rainio vd., 2002; Jiang vd., 1998;Verhulst vd., 1987).

Çizelge 4.5. 10, 25, 40 ve 50 µg/mL linoleik asit içeren YEL besi yerinde gelişen propiyonik asit bakterilerinin toplam KLA üretim miktarları (µg/mL) ve LA’yı KLA’ya dönüştürme oranları (%)

İzola tlar LA konsantrasyonu

80

-: KLA belirlenememiştir.

a,b,c: Her bir sütunda farklı harfler ile gösterilen değerler p<0,05 düzeyinde birbirinden farklıdır.

Lactobacillus, Propionibacterium ve Bifidobacterium cinslerine ait farklı türlerin konjuge linoleik asit üretimlerinin incelendiği bir çalışmada serbest linoleik asit (500 µg/mL) içeren besi yeri ortamında Propiyonibakterilerin, KLA üretim oranları %14-28 arasında, değişmektedir. Propiyonibakteriler içinde en yüksek KLA üretimi P.

freudenreichii subsp. shermanii S28’de 140 µg/mL, olarak, en düşük KLA sentezi ise P.

freudenreichii subsp. shermanii S21’de 70 µg/mL olarak belirlenmiştir. (Yiğit Doğan, 2011). KLA dönüştürme oranları bu çalışmanın sonuçları ile karşılaştırıldığında daha düşüktür, fakat üretilen KLA miktarları daha yüksek oranda substrat kullanıldığı için daha yüksektir. Bakterilerin LA’ya karşı duyarlılığının suşa bağlı değiştiği bilinmekte ve bu duyarlılığın KLA üretim kapasitesini etkilediği bilinmektedir. Yiğit Doğan’ın (2011) çalışmasında kullandığı PAB suşları LA’ya karşı daha dirençli olduklarından ve farklı besi yerinde KLA üretimi gerçekleştirildiğinden dolayı yüksek konsantrasyonlarda KLA üretebilmişlerdir.

Rainio vd. (2001) Propionibacterium freudenreichii subsp. shermanii JS ile KLA üretimi gerçekleştirmek için yaptıkları çalışmada asıl olarak polyoxyethylene sorbitan monooleate kullanarak LA direncini arttırmayı amaçlamışlardır. Linoleik asit içeren (600

10µg/mL 25 µg/mL 40 µg/mL 50 µg/mL

81

µg/mL) MRS besi yerinde herhangi bir deterjan ilavesi olmadığında sadece %0,4 oranında (2,4 µg/mL) KLA üretebilmişlerdir. Kullanılan substrat miktarı bizim çalışmamızdakinden çok daha yüksek olmasına rağmen elde edilen KLA miktarı daha düşüktür. Bizim çalışmamızda 10 µg/mL LA içeren YEL besi yerinde 2,8-7,2 µg/mL KLA, 25 µg/mL LA bulunan ortamda ise 11,8-36,3 µg/mL KLA üretilmiştir.

Propionibacterium ve Bifidobacterium cinslerine ait bazı mikroorganizmaların farklı yağ asitlerini KLA dönüştürme oranlarının incelendiği bir çalışmada P.

freudenreichii subsp. shermanii JS, P. freudenreichii subsp. shermanii 9093, P.

freudenreichii subsp. freudenreichii Propioni-6 ve P. freudenreichii subsp. freudenreichii ATCC 6207 suşlarının linoleik asidi (450 µg/mL) KLA’ya dönüştürme verimlilği çalışılmıştır. En yüksek dönüştürme oranı %47,4 ile P. freudenreichii subsp. shermanii 9093 (214 µg/mL KLA) aittir. Diğer P. freudenreichii subsp. shermanii JS suşu ise aynı ortamda sadece %8,8 dönüşüm sağlayabilmiştir (6 µg/mL KLA). Bu sonuçlar KLA üretim yeteneğinin suş bazında değişebildiğini göstermektedir (Hennessy vd., 2012). Çalışmada ulaşılan en yüksek dönüştürme oranı (%47,4) bu çalışmada bulunan en yüksek dönüştürme oranından (%71,6) düşüktür. Buradan açıkça anlaşılmaktadır ki KLA dönüştürme oranı kullanılan bakterilerin izomerizasyon kapasitesiyle ilgilidir (Hennessy vd., 2012; Jiang vd., 1998)

Yüksek linoleik asit konsantrasyonun KLA üretimini doğrudan etkilediği çalışmamızda da gözlemlenmiştir. Test edilen 40 ve 50 µg/mL LA içeren besi yeri ortamında hiç KLA sentezi gerçekleşmemiştir. Linoleik asidin inhibe edici etkisinden dolayı bu oranlarda bakteri gelişimi ya çok azalmış ya da tamamen durmuştur (Şekil 4.2.).

KLA üretim kapasitelerinin suşa bağlı olarak çok değişiklik gösterdiği bilinmektedir.

Bununla beraber ortam şartlarının da KLA sentezinde etkisi mevcuttur. Bu çalışma kapsamında yüksek KLA üretim potansiyeline sahip PAB izolatları Mihaliç peynir üretiminde kullanılması hedeflendiği için pH ve tuz konsantrasyonunun KLA üretimi üzerindeki etkisi de incelenmiştir. Bu amaçla KLA verimi anlamlı oranda (p<0,05) yüksek olan K32, GS4, ÜP1 ve S14 kodlu izolatlar ile çalışmaya devam edilmiş bu bakterilerin farklı pH’da ve farklı oranda tuz içeren ortamlarda gelişmeleri değerlendirilmiştir.

82

4.5. Propiyonibakterilerin Farklı pH Değerlerine Toleransının Değerlendirilmesi