Laboratuvar Teşhisi

Brucella teşhisinde laboratuvar muayeneleri için kullanılan marazi maddeler fötusa ait kotiledonlar, fötal membranlar, mide içeriği, akciğer, dalak ile abort yapan ineğe ait vajinal sıvap, süt ve kan örnekleridir. Kesilmiş hayvanlara ait karkastan teşhis;

meme dokusu, lenf nodülleri ve dalaktan gerçekleştirilmektedir (Poester ve ark.

2010).

1.1.6.2.1. Antijen Teşhisi

Bakteriyoskopik teşhiste şüpheli materyallerden hazırlanan frotilerin Gram, Ziehl Neelsen ve Köster boyama yöntemleri kullanılarak boyamaları yapılır. Modifiye Ziehl Neelsen metodu kullanıldığında, ışık mikroskobu altında mavi zemin üzerinde kırmızı renkte görülen Brucella etkenleri aranır (Alton ve ark. 1975).

Kültür muayenesinde laboratuvara gönderilen materyallerden çeşitli besi yerlerine ekimler yapılarak etkenin izole edilmesi, tedavi yönteminin belirlenmesi açısından önemlidir. Bu amaçla en çok Brucella medyum ve TSA gibi besi yerleri tercih edilmektedir. B. abortus’un izolasyonu için optimal inkübasyon koşulları;

mikroaerofilik ortamda (%5-10 CO₂), 37^oC ve pH 6.6-7.4 olarak belirlenmiştir.

İnkübasyonun 36-48. saatinden sonra küçük, şeffaf, yüzeyden kabarık, yuvarlak ve düzgün kenarlı, nemli, parlak yüzeyli kolonilerin varlığı gözlenir (OIE 2009).

Brucella’nın sığırlarda teşhisinde PZR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) tabanlı ilk moleküler çalışma 1990 yılında B.abortus S19 suşunun 43 kDA ağırlığında dış membran proteinin 635 bp uzunluğunda bir bölgesinin çoğaltılması ile gerçekleştirilmiştir (Fekete ve ark. 1990). Sonraki yıllarda PZR ile teşhis, genomun Brucella türleri bazında genetik mutasyonun en az olduğu ve korunmuş 16S rRNA (Herman ve De Ridder 1992) ve bcsp31 (Baily ve ark. 1992) gen bölgeleri hedef alınarak dizayn edilen primer dizimleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Brucella genomu tarafından kodlanan ve Brucella türleri arasında ayrım için kullanılabilen omp2 (A-B), omp25, dnaK, groEL, dnaJ, htrA, omp31, hsp65 gibi gen bölgeleri incelenmiştir (Bricker 2002). Sığır ve buffalo kanında PZR ile Brucella etkenlerinin belirlenmesine yönelik bir çalışmada bcsp31, omp2 ve 16S rRNA gen bölgeleri hedef alınmıştır. Kan örneklerinden teşhiste en duyarlı gen bölgesinin bcsp31, bunun yanında en az duyarlı bölgenin 16S rRNA olduğu belirlenmiştir (Mukherjee ve ark.

2007). Konvansiyonel PZR’nin aksine Real Time (Gerçek zamanlı) PZR’nin daha duyarlı, kontaminasyon riskinin az ve yanlış pozitifliklerin engellenebilmesi gibi avantajları göz önüne alınarak ilk çalışma 2001 yılında gerçekleştirilmiştir. Bu araştırmada Brucella türlerine spesifik olduğu belirlenen, Brucella kromozomunda insersiyon sekansı genetik elementini (IS711) (Hailing ve ark. 1993) hedef alan primer dizilimleri kullanılmıştır (Redkar ve ark. 2001). Bunun dışında özellikle insan Brucellozisinin teşhisinde bspc31, 16S-23S ITS, omp25 and omp31 gen bölgeleri hedef alınan primer dizilimleri ve probları kullanılan çalışmalar yapılmıştır (Queipo-Ortuno ve ark. 2005, Kattar ve ark. 2007, Queipo-(Queipo-Ortuno ve ark. 2008, Bounaadja ve ark. 2009). İlk olarak 1994 yılında B. abortus (biovar 2-4), B. melitensis (Biovar 1-2-3), B. ovis ve B. suis (Biovar 1) türlerinin ayrımına yönelik ve IS711 gen bölgesi hedef alınarak geliştirilen multipleks PZR çalışması yapılmıştır (Bricker ve Halling

1994). Daha sonraki yıllarda diğer Brucella türlerinin (B. neotomae, B.

pininipedialis, B. microti, B. ceti ve B. inopinata) ve alt biyovarlarının birbirinden ayrımına yönelik multipleks PZR çalışmaları gerçekleştirilmiştir (Kang ve ark. 2011, Nagalingam ve ark. 2012).

Akış (flow) sitometri Brucella dahil olmak üzere birçok mikroorganizmanın tespitinde kullanılan bir yöntemdir (Cloeckaert ve ark. 1998, Alvarez-Barrientos ve ark. 2000). Brucella için yapısında bulunan dış membran proteinleri ile S ve R form LPS gibi epitop yapılarına karşı oluşan monoklonal antikorlar kullanılarak süspanse kültürden direkt etken teşhisi yapılabildiği, bunun yanında karışık koloniler içerisinde Brucella türleri ve suşların ayrımı da kolaylıkla gerçekleştirildiği rapor edilmiştir (Bowden ve ark. 1995, Fernandez-Prada ve ark. 2006).

1.1.6.2.2. Antikor Teşhisi

Brucella’nın indirekt teşhisinde yaygın bir şekilde kullanılan rose bengal pleyt testi (RBPT) antijeni rose bengal boyası ile boyanmış olan B. abortus standart antijeni S99 veya S1119.3 suşu ile hazırlanmaktadır. Bu aşamada antijen hazırlamada kullanılan buffer’in pH’sı 3.65 düzeyinde olmalıdır. Asidik pH sayesinde IgM aktivitesi engellenerek, IgG’lerin reaksiyona katılması sağlanır ve spesifik olmayan aglütininlerin etkinliği durdurulur. RBPT diğer serolojik testlere oranla daha güvenilir sonuçlar elde edilmesine rağmen özellikle aşılı hayvanlarda meydana gelen IgM’lerin çapraz reaksiyon vermesi ile yanlış pozitif sonuçlara rastlanmıştır (Nielsen 2002, Chothe ve Saxena 2013).

Serum tüp aglütinasyon testi (STAT), tüplerde %5’lik fizyolojik tuzlu su ile seri dilüsyon yapılan şüpheli seruma eşit miktarda standart Brucella aglütinasyon antijeni ilave edilmesi şeklinde gerçekleştirilir. Brucella teşhisinde akut dönemde etkili olan bu test ile aşılama ve enfeksiyona bağlı olarak oluşan antikorları

belirlemesine rağmen IgM ve IgG ayrımlarının yapılamadığı belirlenmiştir. Ayrıca Brucella ile benzer antijen yapısında olan Yersinia enterocolitica, Escherichia coli, Franciella tularensis, Campylobacter fetus gibi bakteriler ile çapraz reaksiyon şekillenebildiği ve yanlış pozitifliklere neden olduğu belirlenmiştir. Testin değerlendirilmesi sırasında 24 saat 37^oC’de inkübasyonu takiben tüpteki sıvının berrak olması ve dibinde tortu oluşması pozitif sonuç olarak kabul edilir. Aşısız hayvanlarda aglütinasyon oluşumu 1/40 ve üzeri dilüsyonlar pozitif, 1/40’ın altındaki dilüsyonlar negatif olarak değerlendirilirken, aşılı hayvanlarda 1/80 ve üzeri dilüsyonlar pozitif, 1/80’in altında dilüsyonlar negatif olarak kabul edilir (Öngör 1999, Aydın 2006).

Komplement fikzasyon testi (CFT) birçok reaktif gerektirmesi ve teknik olarak zor olmasına rağmen daha güvenilir sonuçlar vermesi nedeni ile tercih edilmektedir. Brucella ile doğal enfeksiyon veya aşılama sonrası oluşan immün yanıtın ayrılmasında etkili bir yöntem olan CFT ile IgG1 immünglobulinleri tespit edilmektedir. Testin esası, antijen-antikor kompleksine bağlanan komplementin testte kullanılan koyun eritrositlerini lize etmesidir. Testte kullanılacak antijen, amboseptör ve komplementin daha önceden titre edilmiş olması gerekir. Testin değerlendirilmesinde eritrositlerin parçalanmadan nokta şeklinde çökmesi pozitif, parçalanarak test ortamının rengini kırmızı yapması negatif sonuç olarak kabul edilir (Nielsen 2002, Poester ve ark. 2010).

Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) testi kullanılarak Brucella şüpheli sığırlardan elde edilen serum örneklerinde antikor veya antijenler direkt, indirekt ve kompetatif yöntemler ile saptanır (Nielsen 2002). Aşılama ardından gelişen antikorlar, indirekt ELISA ve diğer serolojik testler ile belirlenemediği için kompetatif ELISA yöntemi geliştirilmiştir. Sonraki yıllarda bu test OIE tarafından Brucellozisin sığır ve domuzlarda belirlenmesi için uluslararası geçerli bir test olduğunu açıklamıştır (OIE 2009).

Bazı serumlarda spesifik Brucella antikorları bulunmasına rağmen aglütinasyon meydana gelmez. Bu tip antikorların, anti-insan globulini (Coombs reaktifi) kullanılarak antijenle reaksiyon vermeleri sağlanabilir. Düşük titrede antikor

bulunan kronik enfeksiyonların tespitinde, Coombs testi ile ELISA karşılaştırıldığında aralarında %7.2-34 oranında bir yanılma olabildiği bildirilmiştir (Araj ve Awar 1997, Araj 2010).

Süt ring testi, aglütinasyon testinden farklı olarak süt örneklerinde Brucella teşhisi için geliştirilmiştir. Kitlesel sürü taramalarında kullanılan süt ring testi;

hematoksilen veya trifenil tetrazolium’la boyanmış antijenlerin, süt içerisinde bulunan Brucella spesifik antikorlar ile bağlanarak kırmızı veya mavi renkte bir halka oluşturma esasına dayanır. Mastitisli memeden alınan bozuk sütler, kolostrum ve laktasyonun geç evrelerinde alınan sütler kullanılarak yapılan testler yanlış sonuçlar verebilmektedir (Poester ve ark. 2010).

Deri testi aşılanmamış sığır, koyun ve keçi sürülerinde Brucellozis’in tanısında kullanılabilecek alternatif bir testtir. Brucellin olarak bilinen allerjenlerle (Brucella lysate, INRA, Brucellergen, Melitin, MBP vs.) yapılan bu test sığır, koyun ve keçilerin kuyruk altına veya boynun yan kısmı derisine 0.1-0.2 ml miktarında uygulanmaktadır. Bu işlemden 48-72 saat sonra deride meydana gelen kalınlaşmanın ölçülmesi ile test sonucu değerlendirilir (OIE 2009).

İndirekt floresan antikor testi (IFAT) ve indirekt hemaglütinasyon yöntemleri kullanılan diğer teşhis metotlarıdır. Son zamanlarda ise daha pratik olan ve Coombs testi gibi antikor engeline takılmaksızın Bruselloziste ortaya çıkan total antikorların saptanmasında kullanılmakta olan Brucellacapt (immunocapture) testi geliştirilmiştir (Orduña ve ark. 2000)