2. PATĠKA BAĞIMLILIĞI KAVRAMI
2.6 Patika Bağımlılığı Örnekleri
2.6.8 Kore Alfabesi ve Patika Bağımlılığı
durante a interação P. brasiliensis-célula A549
Como alguns grupos têm relatado a presença de SFKs em “membrane rafts” (Arcaro e cols., 2007; Sugawara e cols., 2007), investigamos se, durante a interação com P. brasiliensis, SFKs ativas estariam localizadas em “membrane rafts” de células epiteliais. Umas das maneiras para se estudar este fenômeno é o
Figura 8. Efeitos de PP2 e PD98059 na ativação de SFKs e ERK1/2 durante a
interação P. brasiliensis-célula A549
A
B
C
1 2 3
P-SFK
P-ERK1/2
β-actina
1 2 3
Fos for il a ç ã o R e la tiv a d e S F K s Fos for il a ç ã o R e la tiv a d e E R K 1 /2 2.0 1.5 1.0 0.5 01 2 3
0.6 0.4 0.2 0A
B
C
1 2 3
P-SFK
P-ERK1/2
β-actina
1 2 3
Fos for il a ç ã o R e la tiv a d e S F K s Fos for il a ç ã o R e la tiv a d e E R K 1 /2 2.0 1.5 1.0 0.5 01 2 3
0.6 0.4 0.2 0Figura 8. Efeitos de PP2 e PD98059 na ativação de SFKs e ERK1/2 durante a interação P. brasiliensis-célula A549
Células A549 cultivadas em placas de 100 mm foram incubadas com PP2 50 µM ou PD98059 50 µM por 1 hora, e então, com leveduras de P. brasiliensis por 15 minutos. Em seguida, as células foram coletadas e lisadas com M-PER®. Alíquotas contendo 10 μg de proteína foram submetidas a SDS-PAGE e P-SFKs e P-ERK1/2 foram analisadas por “Western blot”. β-actina foi usada para normalização das amostras.
Painel A, “Western blot” com os anticorpos anti-P-SFKs, anti-P-ERK1/2 e anti-β- actina. Resultados similares foram obtidos em três experimentos independentes. A fosforilação relativa de SFKs (Painel B) ou de ERK1/2 (Painel C) foi determinada por análises densitométricas das bandas obtidas no Painel A. Os valores representam a razão da intensidade da banda P-SFKs ou P-ERK1/2 dividida pela intensidade da banda de β-actina correspondente.
Linha 1, células A549.
Linha 2, células A549 tratadas com PP2 50 μM. Linha 3, células A549 tratadas com PD98059 50 μM.
isolamento de DRMs por ultracentrifugação com gradiente de densidade de sacarose. Para isto, células A549 foram incubadas com este fungo por 30 minutos antes do isolamento de DRMs, conforme descrito em Métodos. Como esperado, a Figura 9, painel A superior, mostra a presença do marcador de “membrane rafts” GM1 principalmente nas frações DRM (Figura 9, painel A superior, Frações 2 e 3), tanto das células controle como das células incubadas com P. brasiliensis. Por outro lado, após 30 minutos de incubação das células A549 com leveduras deste fungo, foi observado aumento nos níveis de SFKs ativas (P-SFK) nas frações DRM (Figura 9, painel A superior, Frações 2 e 3). Além disso, utilizando anticorpos anti-SFKs que reconhecem somente SFKs não ativadas, observamos, durante a interação P. brasiliensis-célula A549, o deslocamento de proteínas SFKs (Figura 9, painel A superior e inferior) das frações não-DRM (Frações 6 e 7) para as frações DRM (Frações 2 e 3), sugerindo o recrutamento destas quinases para “membrane rafts” de células epiteliais após incubação com o fungo.
Considerando que “membrane rafts” são enriquecidos em colesterol, verificamos se a depleção desta molécula com MβCD revertia a presença de SFKs nas frações DRM de células A549 pré-incubadas com P. brasiliensis. De fato, quando o homogenato de células A549, previamente incubadas com os fungos, foi tratado com MβCD e em seguida, DRMs destas células foram isoladas, não observamos o enriquecimento de SFKs ativas nas frações DRM (Figura 9, painel B). Além disso, o tratamento de células A549 com MβCD por 30 minutos, seguido da incubação com P. brasiliensis por 15 minutos, inibiu completamente a ativação de SFKs (Figura 10). Estes resultados mostram que o recrutamento e a ativação de SFKs são dependentes de colesterol, indicando, conseqüentemente, que “membrane rafts” são importantes para a ativação destas quinases.
Figura 9. Análise da ativação e localização de SFKs em DRMs de células
A549 incubadas ou não com P. brasiliensis
GM1
P-SFK
A
Controle P. brasiliensis
P 2 3 6 7 P 2 3 6 7
B
-
+
MβCD
SFK
Controle P. brasiliensis
R a z ã o de P- S F K e m D R M / nã o- D R M R a z ã o de SF K e m D R M / nã o- D R M 2.0 1.5 1.0 0.5 0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0GM1
P-SFK
A
Controle P. brasiliensis
P 2 3 6 7 P 2 3 6 7
B
-
+
MβCD
SFK
Controle P. brasiliensis
R a z ã o de P- S F K e m D R M / nã o- D R M R a z ã o de SF K e m D R M / nã o- D R M 2.0 1.5 1.0 0.5 0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 0Figura 9. Análise da ativação e localização de SFKs em DRMs de células A549 incubadas ou não com P. brasiliensis
Painel A, distribuição de P-SFKs, SFKs e o marcador de “membrane rafts” GM1 nas frações DRM (Frações 2 e 3) e não-DRM (Frações 6 e 7) de células A549.
Células A549 cultivadas em placas de 100 mm foram incubadas na presença ou ausência (Controle) de leveduras de P. brasiliensis por 30 minutos. Em seguida, as células foram coletadas e lisadas com Brij®98 1%. A mesma quantidade de proteína da fração pós-nuclear (P) das amostras foi submetida ao gradiente de sacarose e, após ultracentrifugação, sete frações foram coletadas. Alíquotas contendo 1,2 μg das frações DRM e não-DRM e 2,7 μg de proteína da fração P foram analisadas por SDS-PAGE e “Western blot”.
Painel A superior, “Western blot” usando anticorpos anti-P-SFKs, anti-SFKs e a subunidade B da toxina da cólera (CTB) conjugada a biotina, que se liga ao gangliosídeo GM1. Resultados similares foram obtidos em três experimentos independentes. Painel A inferior, os valores representam a razão da quantificação das bandas correspondentes a SFKs nas frações DRM e não-DRM. Painel B, distribuição de P-SFKs nas frações DRM (Frações 2 e 3) e não- DRM (Frações 6 e 7) isoladas de homogenatos de células A549 pré- incubadas com leveduras de P. brasiliensis, tratados (+) ou não (-) com MβCD 10 mM.
Células A549 cultivadas em placas de 100 mm foram incubadas com leveduras de P. brasiliensis por 30 minutos. Em seguida, as células foram coletadas e homogeneizadas com “Dounce tissue grinder”. O homogenato celular foi incubado (+) ou não (-) com MβCD 10 mM por 30 minutos. Então, Brij®98 foi adicionado numa concentração final de 1%. A seguir, DRMs foram isoladas como descrito acima. Alíquotas contendo 0,5 μg das frações DRM (frações 2 e 3) e não-DRM (frações 6 e 7) e 3,0 μg de proteína da fração PNF foram analisadas por SDS- PAGE e “Western blot”. Os valores representam a razão da quantificação das bandas correspondentes a P-SFKs nas frações DRM e não-DRM. Resultados similares foram obtidos em três experimentos independentes.
Figura 10. Efeito da desorganização de “membrane rafts” na ativação de SFKs de células A549 incubadas com P. brasiliensis.
Células A549 cultivadas em placas de 100 mm foram tratadas (+) ou não (-) com MβCD 10 mM por 30 minutos antes da incubação com leveduras de P.
brasiliensis por 15 minutos. Em seguida, as células foram coletadas e lisadas com
M-PER®. Alíquotas contendo 10 μg de proteína foram submetidas a SDS-PAGE e analisadas por “Western blot” usando anticorpos anti-P-SFKs e anti-β-actina. β- actina foi usada para normalização das amostras. Resultados similares foram obtidos em três experimentos independentes.
MβCD
-
+
P-SFK
β-actina
MβCD
-
+
P-SFK
β-actina
DISCUSSÃO
Muitos patógenos desenvolveram a habilidade de manipular a sinalização das suas células-alvo para facilitar o processo de infecção. As interações patógeno-hospedeiro, incluindo a adesão do microorganismo patogênico à superfície da célula hospedeira, podem resultar na ativação de moléculas sinalizadoras do hospedeiro, como tirosina e serina-treonina quinases (Münter e cols., 2006; Riethmüller e cols., 2006).
Trabalhos sobre a modulação da sinalização de células de mamíferos por bactérias patogênicas têm demonstrado o envolvimento de proteínas quinases, dentre as quais MAPKs (“mitogen-activated protein kinases”) e SFKs (“Src-family kinases”) parecem ter grande importância na infecção (Esen e cols., 2001; Wu e cols., 2006). Considerando este fato, verificamos se P. brasiliensis também poderia promover a ativação de ERK1/2 e SFKs durante a interação de leveduras deste fungo com células epiteliais.
De fato, observamos que P. brasiliensis promove a ativação transiente de ERK1/2, observada dos 3 minutos até 3 horas após incubação das células com P.
brasiliensis, apresentando atividade máxima aos 5 minutos. Wu e cols. (2006)
observaram que a bactéria Klebsiella pneumoniae também promoveu a ativação transiente de ERK1/2 em células epiteliais HepG2 (células de hepatoma humano), que ocorreu entre 10 minutos e 1 hora após a infecção, com atividade máxima aos 30 minutos. Portanto, a ativação de ERK1/2 induzida por P. brasiliensis iniciou-se mais rapidamente e foi mais duradoura do que aquela promovida por K.
pneumoniae, Watanabe et al (2001) demonstraram que a bactéria
Porphyromonas gingivalis reduziu a atividade ERK1/2 em células epiteliais
humanas de gengiva de maneira dose-dependente após 15 minutos de infecção, sugerindo que dependendo do patógeno a modulação da atividade ERK1/2 ocorre de diferentes maneiras.
Além de P. brasiliensis estimular a ativação de ERK1/2, verificamos que este fungo também promove a ativação de SFKs, tendo início rápido, aos 3 minutos, atingindo ativação máxima aos 15 minutos, a qual foi mantida por, pelo menos, 3 horas após o contato fungo-célula epitelial. Por outro lado, Esen e cols. (2001) mostraram que a ativação de SFKs, particularmente de Src e Fyn, foi detectada dos 10 minutos até 1 hora, com atividade máxima de 15 a 45 minutos, após incubação das células epiteliais humanas da conjuntiva (células Chang) e pulmonares (células WI-38) com Pseudomonas aeruginosa. Essa bactéria aumentou a ativação de Src e Fyn em aproximadamente 4 e 5 vezes, respectivamente, quando comparada aos níveis basais (o aumento da ativação de SFKs induzida por P. brasiliensis foi de aproximadamente 6 vezes). Assim, os resultados obtidos com P. aeruginosa corroboram os obtidos com P. brasiliensis. As diferenças observadas quanto ao início, intensidade e duração da ativação de SFKs promovida por esses dois microorganismos provavelmente se devem à variação da ativação de SFKs dependendo da linhagem celular estudada e/ou ao fato do processo de adesão e invasão de P. aeruginosa ser muito mais rápido que o de P. brasiliensis, fazendo com que o tempo de ativação de SFKs seja mais curto.
Considerando que ∅vrevik e cols. (2004) demonstraram que SFKs regulam a ativação de ERK1/2 induzida por sílica cristalina, analisamos se a ativação,
detectada após incubação das células A549 com P. brasiliensis, de ERK1/2 é dependente de SFKs e vice-versa. Verificamos que o tratamento das células com PD98059, inibidor da ativação da via ERK1/2, não afetou a ativação de SFKs induzida por P. brasiliensis. Entretanto, a incubação das células com PP2, inibidor da atividade de SFK, reduziu a ativação de ERK1/2 em 40%, indicando que a ativação desta quinase é parcialmente dependente de SFKs ativadas e que provavelmente outras quinases também estão envolvidas na ativação de ERK1/2.
Como diversos grupos têm mostrado a presença de SFKs nos “membrane rafts” (Sugawara e cols., 2007; Bouillon and cols., 2003; Gagnoux-Palacios e cols., 2003; Kannan e cols., 2006), investigamos se P. brasiliensis poderia induzir a ativação e o recrutamento destas quinases para os domínios de membranas em células epiteliais. De fato, observamos que formas ativas de SFKs estavam presentes nas frações DRM isoladas de células A549 após interação com P.
brasiliensis. O deslocamento de SFKs das frações não-DRM para frações DRM
durante a interação P. brasiliensis-célula epitelial, indica que este fungo promove o aumento da afinidade destas quinases por “membrane rafts”. Além disso, após a depleção do colesterol das membranas pelo tratamento com MβCD, não foi observada a ativação de SFKs em células A549 incubadas com P. brasiliensis, corroborando desta maneira a importância de “membrane rafts” para a ativação destas quinases.
Considerando que estudos prévios têm destacado a habilidade de uma variedade de patógenos de seqüestrar “membrane rafts” de células de mamíferos com o intuito de infectá-las (Mañes e cols., 2003; Riethmüller e cols., 2006), investigamos se “membrane rafts” das células epiteliais A549 (células de pulmão
humano) e Vero (células de rim de macaco) estariam envolvidos na adesão de leveduras de P. brasiliensis.
Para analisar a formação de “membrane rafts”, a subunidade B da toxina da cólera (CTB) tem sido freqüentemente utilizada por apresentar alta afinidade pelo gangliosídeo GM1, que é considerado um marcador destes domínios de membranas celulares. Assim, após a confirmação da presença de GM1 nas células epiteliais A549 e Vero, e da especificidade de CTB pelo GM1 presente nestas células, utilizamos esta toxina para a localização de GM1 em células epiteliais incubadas com P. brasiliensis. Por microscopia de fluorescência, verificamos o recrutamento de GM1 para os sítios de contato P. brasiliensis-célula epitelial, sugerindo que este fungo promove o agrupamento e a estabilização de domínios de membranas destas células durante a interação. De fato, vários grupos têm demonstrado o recrutamento do gangliosídeo GM1 como sendo indicativo do envolvimento de “membrane rafts” na interação patógeno-célula hospedeira. Seveau e cols. (2004), Yamamoto e cols. (2005) e Brown e cols. (2002), por exemplo, mostraram forte fluorescência com CTB nas regiões de contato entre Listeria monocytogenes e células Vero (células epiteliais de rim de macaco), entre P. aeruginosa e hTCEpi (células epiteliais de córnea humana), e entre o vírus sincicial respiratório (“respiratory syncytial vírus”, RSV) e células Vero C1008, respectivamente.
Além de sua função na estabilização dos “membrane rafts”, gangliosídeos como GM1 e GM3 podem funcionar também como receptores para P. brasiliensis, já que estes glicolipídeos se ligam diretamente ao fungo (C.Y. Ywazaki, P.K. Maza, E. Suzuki, H.K. Takahashi, A.H. Straus, manuscrito em preparação). E, uma forte evidência da participação dos gangliosídeos GM1 e GM3 na adesão de
P. brasiliensis consiste na significativa inibição da adesão do fungo a fibroblastos de pulmão humano após tratamento das células com um anticorpo monoclonal anti-GM3 ou com CTB (C.Y. Ywazaki, P.K. Maza, E. Suzuki, H.K. Takahashi, A.H. Straus, manuscrito em preparação). Além de gangliosídeos, receptores como integrinas e “Toll-like receptors” (TLRs) também podem ser encontrados nos “membrane rafts” (Toledo e cols., 2005; Soong e cols., 2004). Assim, daremos continuidade a este trabalho analisando se P. brasiliensis poderia promover o recrutamento destes receptores para os domínios de membranas de células epiteliais.
Como “membrane rafts” são enriquecidos em colesterol, drogas que seqüestram esta molécula desorganizam os domínios de membranas e são comumente usadas como ferramentas para o estudo de suas funções nos processos celulares. Exemplos dessas drogas são a metil-β-ciclodextrina (MβCD), composto que extrai o colesterol (Kilsdonk e cols., 1995), e nistatina, antibiótico que se liga ao colesterol sem, no entanto, removê-lo (Anderson e cols., 2000). Assim, a sensibilidade a essas drogas em diferentes eventos biológicos vem sendo considerada um indicador da participação de “membrane rafts”. Por ensaios de adesão, demonstramos que o tratamento de células epiteliais com essas drogas, previamente à incubação com P. brasiliensis, promoveu a inibição significativa da adesão do fungo. Além disso, a reposição do colesterol aumentou significativamente em aproximadamente 50% a adesão de P. brasiliensis em relação às células tratadas com MβCD. Outros grupos também demonstraram o envolvimento de “membrane rafts” de células epiteliais durante a infecção por patógenos utilizando drogas que desorganizam estes domínios de membranas celulares. Lafont e cols. (2002) e Riff e cols. (2005), por exemplo, relataram que a
adesão, respectivamente, de bactérias do gênero Shigella e de Escherichia coli, foi significativamente reduzida após o tratamento de células epiteliais com MβCD. Além disso, Seveau e cols (2004) utilizaram o seqüestro e a reposição do colesterol para demonstrar que a inibição da invasão de L. monocytogenes a células epiteliais foi especificamente resultante do tratamento das células com MβCD. Stuart e cols. (2003) mostraram, pelo tratamento com nistatina e filipina, que algumas espécies do gênero Chlamydiae invadem células HeLa 229 via “membrane rafts”. Fernandes e cols. (2007) também demonstraram, por diferentes metodologias, dentre as quais a depleção de colesterol por MβCD, o envolvimento de domínios de membranas de células Vero e HeLa na invasão de formas tripomastigotas metacíclicas e amastigotas extracelulares de
Trypanosoma cruzi. Todos estes dados mostram, portanto, que “membrane rafts”
da célula hospedeira são importantes para o estabelecimento da infecção por diferentes patógenos.
Apesar dos resultados obtidos mostrarem que “membrane rafts” são importantes para a adesão de P. brasiliensis e que este fungo promove a ativação de SFKs e de ERK1/2, e embora alguns trabalhos tenham verificado a importância da ativação destas quinases para a adesão e/ou invasão de bactérias patogênicas a células epiteliais (Evans e cols., 2002; Kannan e cols., 2006), não conseguimos demonstrar a relação direta entre estas quinases e a adesão de P.
brasiliensis. Resultados de quatro experimentos diferentes mostraram em células
pré-incubadas com PP2 e PD98059, que estes inibidores promovem apenas uma discreta inibição (entre 10 e 20%), estatisticamente não significativa, da adesão deste fungo (dados não-mostrados). Portanto, isto indica que outras moléculas, como por exemplo, FAK (“focal adhesion kinase”) e Rho GTPases, podem ter um
impacto mais relevante neste evento. Ainda, considerando-se os resultados de ∅vrevik e cols. (2004), sobre o envolvimento de SFKs e de ERK1/2 na liberação de IL-8, induzida por sílica cristalina, em células A549, torna-se de interesse investigarmos se a ativação de SFKs e ERK1/2, promovida por P. brasiliensis, estaria relacionada com a expressão e a liberação de citocinas inflamatórias.
Assim, demonstramos que P. brasiliensis promove o recrutamento de “membrane rafts”, evento essencial para a adesão a células epiteliais e para a ativação de SFKs. Além de SFKs, este fungo também induz a ativação de ERK1/2. Os resultados apresentados nesta tese mostram, pela primeira vez, que fungos patogênicos podem utilizar estes domínios de membranas de células hospedeiras para o estabelecimento da infecção.
CONCLUSÕES
1. Por microscopia de fluorescência utilizando a subunidade B da toxina da cólera (CTB), demonstramos que P. brasiliensis induz o recrutamento do gangliosídeo GM1, um marcador de “membrane rafts”, para os sítios de contato entre o fungo e a célula epitelial.
2. Por ensaios de adesão após tratamento de células epiteliais com metil-β- ciclodextrina (MβCD) ou nistatina, verificamos a inibição da adesão de P.
brasiliensis, sugerindo o envolvimento de “membrane rafts” neste evento.
3. Por “Western blot”, mostramos que P. brasiliensis promove a ativação de SFKs (“Src-family kinases”) e ERK1/2 (“Extracellular signal-regulated kinase 1/2”) em células epiteliais.
4. Por “Western blot”, utilizando PP2 (inibidor da atividade SFK) e PD98059 (inibidor da via de ativação de ERK1/2), demonstramos que a ativação de ERK1/2 em células epiteliais, induzida por P. brasiliensis, é parcialmente dependente da ativação de SFKs.
5. Por “Western blot”, após o isolamento de DRMs (“detergent-resistant membranes”), mostramos que P. brasiliensis promove a ativação e o deslocamento de SFKs para “membrane rafts”.
6. Por “Western blot”, utilizando MβCD, verificamos que “membrane rafts” são importantes para a ativação de SFKs em células epiteliais, induzida por P.
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