DNA'nın Kontrolü

2 μl (100 ng) DNA çözeltisi %1’lik agaroz jelde elektroforez işlemine tabi tutuldu. DNA saflığının ölçülmesi için, NanoDrop Spektrofotometre cihazında 260/280 nm dalga boyunda ölçüm yapıldı.Kontrolü tamamlanan DNA molekülleri, DNA sekans analizine başlamak üzere +40_{C’de saklandı.}

ACE Geni İçin PCR Koşulları ; ACE geni için özgül olan oligonükleotid primerler ile PCR amplifikasyonu gerçekleştirilmiştir. PCR işlemi için toplamda 25 µl olacak şekilde; içerisinde; 1µl genomic DNA , Gene Amp Gold Buffer (15 mmol/l Tris-HCl, pH 8.0, 50 mmol/lKCl), 2.5 mmol MgCl2 hazırlandı her birinden 50 µmol/l dGTP,dATP, dTTP ve

dCTP, 5 pmol forward ve reverse primer ve 1.0U Ampli Taq Gold polimeraz eklendi.

PCR reaksiyonu 1 ul (100 ng) genomik DNA, Enhancer Buffer (20 mM Tris (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mMMgCl2) 2.5 uL, d NTP mix karışımı 0.5 uL (0.2 mM), forward primer 1 uL (10 pmol/ul), reverse primer 1 ul (10 pmol/ul) (Invitrogen) , 1.0 U PlatiniumTaq DNA Polymerase (Invitrogen, Carlsbad, CA), deiyonize su ile 25 uL total volüme tamamlanmıştır. MyGene Gradient Thermal Cycler cihazında gradient programında PCR amplifikasyonu gerçekleştirilmiştir.

PCR örnekleri %2 lik jel hazırlanarak görüntülenir.(D allel 500bp,I allel 200bp )

APOB Geni İçin PCR Koşulları ; APOB geni için özgül olan oligonükleotid primerler ile PCR amplifikasyonu gerçekleştirilmiştir. PCR işlemi için toplamda 25 µl olacak şekilde; içerisinde; 1µl genomic DNA , Gene Amp Gold Buffer (15 mmol/l Tris-HCl, pH 8.0, 50 mmol/lKCl), 2.5 mmol MgCl2 hazırlandı her birinden 50 µmol/l dGTP,dATP, dTTP ve

dCTP, 5 pmol forward ve reverse primer ve 1.0U Ampli Taq Gold polimeraz eklendi.

PCR reaksiyonu 1 ul (100 ng) genomik DNA, Enhancer Buffer (20 mM Tris (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mMMgCl2) 2.5 uL, d NTP mix karışımı 0.5 uL (0.2 mM), forward primer 1 uL (10 pmol/ul), reverse primer 1 ul (10 pmol/ul) (Invitrogen) , 1.0 U PlatiniumTaq DNA Polymerase (Invitrogen, Carlsbad, CA), deiyonize su ile 25 uL total volüme tamamlanmıştır. MyGene Gradient Thermal Cycler cihazında gradient programında PCR amplifikasyonu gerçekleştirilmiştir.

PCR örnekleri %2lik jel hazırlanarak görüntülenir.(PCR bandı 334 bp ). PCR ürünleri MSP1 restriksiyon enzimi kullanılarak 37 o_{C’de en az 16 saat inkübasyona bırakılır . %3lük}

agaroz jelde görüntülenir.( GG- 313 bp + 21 bp , GA-334 bp + 313bp + 21bp , AA-334bp )

CYP11B2 Geni İçin PCR Koşulları ; CYP11B2 geni için özgül olan oligonükleotid primerler ile PCR amplifikasyonu gerçekleştirilmiştir. PCR işlemi için toplamda 25 µl olacak şekilde; içerisine 1µl genomic DNA , Gene Amp Gold Buffer (15 mmol/l Tris-HCl, pH 8.0, 50 mmol/lKCl), 2.5 mmol MgCl2 hazırlandı her birinden 50 µmol/l dGTP,dATP, dTTP ve

dCTP, 5 pmol forward ve reverse primer ve 1.0U Ampli Taq Gold polimeraz eklendi.

PCR reaksiyonu 1 ul (100 ng) genomik DNA, Enhancer Buffer (20 mM Tris (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mMMgCl2) 2.5 uL, d NTP mix karışımı 0.5 uL (0.2 mM), forward primer 1 uL (10 pmol/ul), reverse primer 1 ul (10 pmol/ul) (Invitrogen) , 1.0 U PlatiniumTaq DNA Polymerase (Invitrogen, Carlsbad, CA), deiyonize su ile 25 uL total volüme tamamlanmıştır. MyGene Gradient Thermal Cycler cihazında gradient programında PCR amplifikasyonu gerçekleştirilmiştir.

PCR örnekleri %2lik jel hazırlanarak görüntülenir(PCR bandı 537 bp ). PCR ürünleri Hae III restriksiyon enzimi kullanılarak 37 o_{C’de en az 16 saat inkübasyona bırakılır, %3’lük}

agaroz jelde görüntülenir( TT-273 bp+138bp , TC-273bp +202bp+ 138bp, CC- 202bp+138bp).

FABP2 Geni İçin PCR Koşulları ; FABP2 geni için özgül olan oligonükleotid primerler ile PCR amplifikasyonu gerçekleştirilmiştir. PCR işlemi için toplamda 25 µl olacak şekilde; içerisinde; 1µl genomic DNA , Gene Amp Gold Buffer (15 mmol/l Tris-HCl, pH 8.0, 50 mmol/lKCl), 2.5 mmol MgCl2 hazırlandı her birinden 50 µmol/l dGTP,dATP, dTTP ve

dCTP, 5 pmol forward ve reverse primer ve 1.0U Ampli Taq Gold polimeraz eklendi.

PCR reaksiyonu 1 ul (100 ng) genomik DNA, Enhancer Buffer (20 mM Tris (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mMMgCl2) 2.5 uL, d NTP mix karışımı 0.5 uL (0.2 mM), forward primer 1 uL (10 pmol/ul), reverse primer 1 ul (10 pmol/ul) (Invitrogen) , 1.0 U PlatiniumTaq DNA Polymerase (Invitrogen, Carlsbad, CA), deiyonize su ile 25 uL total volüme tamamlanmıştır. MyGene Gradient Thermal Cycler cihazında gradient programında PCR amplifikasyonu gerçekleştirilmiştir.

PCR örnekleri %2lik jel hazırlanarak görüntülenir.(PCR bandı 180 bp ). PCR ürünleri Hha restriksiyon enzimi kullanılarak 37 o_{C’de en az 16 saat inkübasyona bırakılır . %3lük}

RENİN Geni İçin PCR Koşulları ; Renin geni için özgül olan oligonükleotid primerler ile PCR amplifikasyonu gerçekleştirilmiştir. PCR işlemi için toplamda 25 µl olacak şekilde; içerisinde; 1µl genomic DNA , Gene Amp Gold Buffer (15 mmol/l Tris-HCl, pH 8.0, 50 mmol/lKCl), 2.5 mmol MgCl2 hazırlandı her birinden 50 µmol/l dGTP,dATP, dTTP ve

dCTP, 5 pmol forward ve reverse primer ve 1.0U Ampli Taq Gold polimeraz eklendi.

PCR reaksiyonu 1 ul (100 ng) genomik DNA, Enhancer Buffer (20 mM Tris (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mMMgCl2) 2.5 uL, d NTP mix karışımı 0.5 uL (0.2 mM), forward primer 1 uL (10 pmol/ul), reverse primer 1 ul (10 pmol/ul) (Invitrogen) , 1.0 U PlatiniumTaq DNA Polymerase (Invitrogen, Carlsbad, CA), deiyonize su ile 25 uL total volüme tamamlanmıştır. MyGene Gradient Thermal Cycler cihazında gradient programında PCR amplifikasyonu gerçekleştirilmiştir.

PCR'ı başarılı olan hastaların ürünleri ABI 3130XL Genetic Analyser otomatik DNA dizileme cihazına konuldu ve piklere göre nükleotid dizisi okundu.

Otomatik DNA dizi analiz cihazları basit olarak, sabit bilgisayarda yüklü programlar ile bu programların yönettiği elektroforez sistemini içerir. Elektroforetik ünitelerde bulunan lazer ışık kaynağı ile monokromatik bir ışık oluşturulur. Söz konusu DNA’ nın bulunduğu jelmatriks bu monokromatik ışık ile taranır. Elektroforez süresince DNA’ya bağlanan floresan boya ışık ile taranan bölgeye geldiğinde uyarılır. Uyarılan boya kendi için karakteristik olan dalga boyunda ışığı geri yansıtır. Yansıyan bu ışık demeti bir detektör tarafından kaydedilir. Kaydedilen veriler bilgisayar programları ile değerlendirilir ve sonuçlar grafiksel olarak bilgisayar ekranına aktarılarak değerlendirilir.

8.6.Veri Analizi ve İstatistik Değerlendirme

Araştırma sonuçlarının tanımlayıcı olarak sunulması olgu ve kontrol gruplarına göre yapılmıştır. Tanımlayıcı analizde, niceliksel ölçüm veri olarak alınan değişkenlerin normal dağılımlara uygunluğu kontrol edildi. Veri normal dağılıma uygun değil ise, logaritmik dönüşüm uygulandı, normal dağılım kontrolü tekrar yapıldı. Her durumda normal dağılım göstermeyen veri ortanca (minimum-maksimum) değerlerle gösterildi. Normal dağılıma uygunsa; ortalama ±SD ile gösterildi. Frekans dağılımlarda sayı ve yüzde dağılımlar kontrol edildi.

Analitik değerlendirmede bağımsız grupların karşılaştırılmasında, parametrik olan sürekli veriler için ortalamalar t-test, nonparametrik karşılaştırmalar Mann Whitney-U test ile gerçekleştirildi.

Kategorik değişkenlerin olgu ve kontrol gruplarında sıklık farkı bağımsız gruplarda Ki-kare testi, tedavi öncesi sonrası bağımlı koşulda McNemar Ki-kare testi ile analiz edildi. Tedavi öncesi sonrası kan basıncı ölçümleri, parametrik koşulda paired t-test, nonparametrik koşulda wilcoxon test ile karşılaştırıldı.

Her genin obezite değişkeni VKİ’nin düzeltildiği çok değişkenli incelemede lojistik regresyon ile çözümleme gerçekleştirildi. Her bir grubun genotip allel sıklıklarının Hardy Weinberg dengesinde olup olmadığı kontrol edildi.

Tüm karşılaştırmalarda p<0.05 anlamlılık sınır değeri olarak kabul edildi.

8.7.Araştırma İle İlgili Etik Durumlar

Çalışma Helsinki Deklarasyonu Kararları’na, Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Yerel Etik Kurulu, Hasta Hakları Yönetmeliği’ne ve etik kurallara uygun olarak düzenlendi.

Araştırma için EÜTF klinik araştırmalar etik kurulundan etik izin alınarak gerçekleştirildi.