2.2. Matematik Alanındaki Çalışmaları
2.3.2. Konikler Üzerine Denemesi
2.3.3.1. Kazanmaya Dair Sorular
Na 2º grande escala de BRF074, a linhagem foi cultivada em dez litros (10 L) de meio de cultura batata-dextrose-levedura (BDL) em água do mar sintética.
O meio BDL foi distribuído em 50 frascos de Erlenmeyers de 500 mL, que foram vedados com tampão de algodão hidrofóbico e autoclavados a 121ºC.1atm-1 por 15 min. O
inoculo de BRF074 foi realizado em 48 frascos e dois frascos foram reservados como experimento controle. A fermentação foi conduzida à temperatura ambiente sob condições estáticas durante 14 dias. Ápos filtração a vácuo o meio líquido foi separado do micélio e extraído com AcOEt. A fração orgânica foi concentrada obtendo-se 1,5 g de um material resinoso amarronzado denominada BRF074-BDL.
7.6.6 Cultivo em grande escala de BRF074 em meio de cultura MPD
Para o primeiro cultivo em grande escala da cepa BRF074, sete litros (7 L) de meio de cultura malte-peptona-dextrose (MPD) em água do mar sintética foram distribuídos em 56 frascos de Erlenmeyer de 500 mL de capacidade. Cada frasco foi vedado com tampão de algodão hidrofóbico e autoclavado a 121ºC.1atm-1 por 15 min.
Após o procedimento de esterilização, dois frascos contendo apenas o meio de cultivo foram mantidos como experimento controle e os 54 frascos restantes foram inoculados com a cepa BRF074. A incubação foi realizada sob condições estáticas à temperatura ambiente e ao final de um período de 7 dias de crescimento, separou-se o micélio do meio líquido por filtração à vácuo. O micélio foi descartado e o meio líquido extraído com AcOEt. A fração orgânica foi concentrada obtendo-se 535,6 mg de uma resina de coloração marrom denominada BRF074-MPD.
7.7 Estudo químico
7.7.1 Estudo químico do extrato BRF074-BD
Um total de sete alíquotas de 500 mg do extrato BRF074-BD foram submetidas a fracionamento cromatográfico em cartucho de sílica quimicamente modificada C-18 (Strata Phenomenex®) de 7 cm de altura e 3 cm de diâmetro. Para cada alíquota a eluição foi conduzida utilizando-se 50 mL de misturas de solventes H2O e MeOH em diferentes
proporções. As massas dessas frações estão descritas na Tabela 29 (p. 175). Tabela 29 - Rendimento fracionamento cromatográfico de BRF074-BD
Fração Eluente Sigla Massa Rendimento
1 H2O 100% BRF074-BD-F1 2600,0 mg 74,3% 2 H2O/MeOH 8:2 BRF074-BD-F2 94,5 mg 2,7% 3 H2O/MeOH 6:4 BRF074-BD-F3 84,2 mg 2,4% 4 H2O/MeOH 1:1 BRF074-BD-F4 91,2 mg 2,6% 5 MeOH/H2O 7:3 BRF074-BD-F5 129,7 mg 3,7% 6 MeOH/H2O 8:2 BRF074-BD-F6 143,2 mg 4,1% 7 MeOH/H2O 9:1 BRF074-BD-F7 93,4 mg 2,7% 8 MeOH 100% BRF074-BD-F8 32,3 mg 0,9% Total 3268,5 mg 93,4%
Fonte: Elaborada pelo autor
7.7.1.1 Análises cromatográficas das amostras obtidas no fracionamento do extrato BRF074- BD
Todas as frações obtidas no fracionamento em cartucho C18 foram submetidas à análise por CLAE, utilizando coluna analítica no modo reverso e gradiente H2O/CH3CN com
a concentração de CH3CN variando de 20% à 80% em 30 minutos, com fluxo de 1 mL.min-1.
A amostra foi injetada na concentração de 1mg.mL-1. A partir da análise dos cromatogramas
obtidos, foi desenvolvido um método isocrático para as frações BRF074-BD (F3 à F6) que além de apresentar um perfil cromatográfico interessante, também possuíam massa significativa para o isolamento dos seus constituintes químicos.
7.7.1.2 Fracionamento em CLAE de BRF074-BD-F3
A fração BRF074-BD-F3 (84,2 mg) foi submetida à análise por CLAE, utilizando coluna analítica (modo reverso) para desenvolvimento de um método isocrático, para melhor separação dos seus constituintes químicos. Com a amostra na concentração de 1 mg.mL-1 e
um fluxo de 1 mL.min-1, foi possível chegar a um método isocrático H
2O/CH3CN 80:20 onde
observou-se boa separação dos picos. O cromatograma referente à análise está apresentado na Figura 111 (p. 176).
Figura 111 - Cromatograma do fracionamento em CLAE de BRF074-BD-F3.
Fonte: Elaborada pelo autor
Esse método foi reproduzido em uma coluna semi-preparativa, também operado no modo reverso, com fluxo de 4,72 mL.min-1 e amostra na concentração de 10 mg.mL-1.
Foram coletadas 7 frações, cuja massas e tempos de retenção estão descritas na Tabela 30 (p. 177). As amostras referentes aos picos 4, 5 e 6 foram submetidas à análise por RMN e apresentaram-se como substâncias puras, recebendo os códigos BRF074 (1) (5,2 mg; tr: 8,48 min), BRF074 (2) (6,1 mg; tr: 12,26 min) e BRF074 (3) (7,0 mg; tr: 16,36 min), respectivamente.
(1)
(2)
Tabela 30 - Massas das frações coletadas no fracionamento em CLAE da amostra BRF074-BD-F3 Fração Tempo de retenção Massa Rendimento Trecho 1 0,01 – 13,00 min 31,8 mg 37,7% Trecho 2 13,01 – 20,00 23,1 mg 27,4% Pico 1 6,37 min 1,7 mg 2,0% Pico 2 6,96 min 2,6 mg 3,1% Pico 3 8,13 min 4,0 mg 4,8% Pico 4 8,48 min 5,2 mg 6,1% Pico 5 12,26 min 6,1 mg 7,3% Pico 6 16,36 min 7,00 mg 8,3% Total 81,4 mg 96,7%
Fonte: Elaborada pelo autor
7.7.1.3 Fracionamento de BRF074-BD-F4
A fração BRF074-BD-F4 (90,0 mg) foi submetida a analise em CLAE utilizando coluna semi-preparativa de fase reversa. A separação foi efetuada empregando-se como fase móvel H2O/CH3CN (70:30), com fluxo de 4,72 mL.min-1 e amostra na concentração de 10
mg.mL-1. O cromatograma (FIGURA 112, p. 177) mostrou a separação de 5 picos, cujas
massas e tempos de retenção estão descritas na Tabela 31 (p. 178). Figura 112 - Cromatograma do fracionamento em CLAE de BRF074-BD-F4
Fonte: Elaborada pelo autor
(4)
(5)
Tabela 31 - Massas das frações coletadas no fracionamento em CLAE da amostra BRF074-BD-F4 Fração Tempo de retenção Massa Rendimento
Pico 1 4,55 min 2,1 mg 2,3% Pico 2 4,91 min 3,5 mg 3,9% Pico 3 5,41 min 4,2 mg 4,7% Pico 4 8,06 min 11,6 mg 12,9% Pico 5 12,45 min 5,5 mg 6,1% Purga -- 59,4 mg 66,0% Total 86,4 mg 95,9%
Fonte: Elaborada pelo autor
Os compostos referentes aos picos 3 (4,2 mg; tr 5,41 min) e 4 (11,6 mg; tr: 8,06 min) foram submetidos à análise por RMN e apresentaram-se como substâncias puras. Esses compostos foram denominados BRF074 (4) e BRF074 (5), respectivamente.
7.7.1.4 Fracionamento de BRF074-BD-F5
A fração BRF074-BD-F5 (129,7 mg) foi purificada por CLAE utilizando uma coluna semi-preparativa de fase reversa. A amostra foi injetada na concentração de 20 mg.mL-1, utilizando fluxo de 4,72 mL.min-1 e método isocrático H
2O/CH3CN (65:35). O
cromatograma (FIGURA 113, p. 178) referente a análise mostrou apenas um pico majoritário com tempo de retenção 8,44 min, que após evaporação do solvente forneceu 20,1 mg de um composto codificado BRF074 (6).
Figura 113 - Cromatograma do fracionamento em CLAE de BRF074-BD-F5
Fonte: Elaborada pelo autor
7.7.1.5 Fracionamento em CLAE de BRF074-BD-F6
A fração BRF074-BD-F6 (143,2 mg) foi submetida à análise por CLAE, utilizando coluna analítica (modo reverso) para desenvolvimento de um método isocrático, para melhor separação dos seus constituintes químicos. Com a amostra na concentração de 1 mg.mL-1 e um fluxo de 1 mL.min-1, foi possível chegar a um método isocrático H
2O/CH3CN
50:50 onde observou-se boa separação dos picos. O cromatograma referente à análise está apresentado na FIGURA 114 (p. 179).
Figura 114 - Cromatograma do fracionamento em CLAE de BRF074-BD-F6
Fonte: Elaborada pelo autor
A separação foi efetuada em coluna semi-preparativa empregando-se como fase móvel H2O/CH3CN (50:50), com fluxo de 4,72 mL.min-1 e amostra na concentração de
10 mg.mL-1. As massas e tempo de retenção obtidos estão descritos na Tabela 32 (p. 179).
Tabela 32 - Massas das frações coletadas no fracionamento em CLAE da amostra BRF074-BD-F6 Fração Tempo de retenção Massa Rendimento
Pico 1 10,49 min 29,3 mg 2,3%
Pico 2 11,24 min 13,1 mg 3,9%
Purga -- 96,4 mg 66,0%
Total 86,4 mg 96,9%
Fonte: Elaborada pelo autor
Os compostos referentes aos picos 1 (29,3 mg; tr: 10,49 min) e 2 (13,1 mg; tr: 11,24 min) foram submetidos à análise por RMN, no entanto apenas o pico 1 apresentou-se como substância pura. Esse composto foi denominado BRF074 (7).
7.7.2 Estudo químico do extrato BRF074-BDL
Uma alíquota de 500 mg do extrato BRF074-BDL foi submetida a fracionamento cromatográfico em cartucho de sílica quimicamente modificada C-18 (Strata Phenomenex®) de 7 cm de altura e 3 cm de diâmetro. Para cada alíquota a eluição foi conduzida utilizando-se 50 mL de misturas de solventes H2O e MeOH em diferentes proporções. As massas dessas
frações, após combinadas, estão descritas na Tabela 33 (p. 180). Tabela 33 - Rendimento fracionamento cromatográfico de BRF074-BDL
Fração Eluente Sigla Massa Rendimento
1 H2O 100% BRF074-BDL-F1 32,5 mg 6,5% 2 H2O/MeOH 8:2 BRF074-BDL-F2 28,4 mg 5,7% 3 H2O/MeOH 6:4 BRF074-BDL-F3 47,8 mg 9,6% 4 H2O/MeOH 1:1 BRF074-BDL-F4 36,7 mg 7,3% 5 MeOH/H2O 7:3 BRF074-BDL-F5 54,3 mg 10,8% 6 MeOH/H2O 8:2 BRF074-BDL-F6 251,0 mg 50,2% 7 MeOH/H2O 9:1 BRF074-BDL-F7 21,6 mg 4,3% 8 MeOH 100% BRF074-BDL-F8 26,1 mg 5,2% Total 498,4 mg 99,6%
Fonte: Elaborada pelo autor
7.7.2.1 Análises cromatográficas das amostras obtidas no fracionamento do extrato BRF074- BDL
Todas as frações obtidas no fracionamento em cartucho C18 foram submetidas à análise por CLAE, utilizando coluna analítica no modo reverso e gradiente H2O/CH3CN com
a concentração de CH3CN variando de 20% à 100% em 40 minutos, com fluxo de
1 mL.min-1. A amostra foi injetada na concentração de 1 mg.mL-1.
A comparação entre os perfis cromatográficos das frações obtidas no 2° cultivo em grande escala de BRF074 (meio de cultura BDL) e as frações do 1° cultivo de BRF074 (meio de cultura BD) mostrou que de todas as frações analisadas, as únicas que apresentavam
diferenças significativas quanto ao seu perfil cromatográfico foram as frações BRF074-BDL- F3, BRF074-BDL-F6, BRF074-BDL-F7 e BRF074-BDL-F8. As três ultimas fracoes mencionadas revelaram possuir composições químicas semelhantes.
7.7.2.2 Fracionamento em CLAE de BRF074-BDL-F3
A fração BRF074-BDL-F3 (47,8 mg) foi purificada por CLAE utilizando uma coluna semi-preparativa de fase reversa. A amostra foi injetada na concentração de 15 mg.mL-1, utilizando fluxo de 4,72 mL.min-1 e método isocrático H
2O/CH3CN (15:85). O
cromatograma (FIGURA 115, p. 181) referente a análise mostrou um pico majoritário com tempo de retenção 6,46 min, que após evaporação do solvente forneceu 6,7 mg de um composto codificado BRF074 (8).
Figura 115 - Cromatograma do fracionamento em CLAE de BRF074-BDL-F3
Fonte: Elaborada pelo autor
7.7.2.3 Fracionamento em CLAE de BRF074-BDL-F6
A fração BRF074-BDL-F6 foi submetida à análise por CLAE, utilizando coluna semi-preparativa de fase reversa. A separação foi efetuada em condições isocráticas,
empregando-se como fase móvel H2O/CH3CN (50:50), com fluxo de 4,72 mL.min-1 e amostra
na concentração de 20 mg.mL-1. O cromatograma (FIGURA 116, p. 182) exibiu 2 picos, pico
1 (9,7 mg; tr: 8,45) e pico 2 (19,6 mg; tr: 9,33 min), que se apresentaram como substâncias puras após análise por RMN e foram denominados BRF074 (9) e BRF074 (10), respectivamente.
Figura 116 - Cromatograma do fracionamento em CLAE de BRF074-BDL-F6.
Fonte: Elaborada pelo autor
7.7.3 Estudo químico do extrato BRF074-MPD
Uma alíquota de 500 mg do extrato BRF074-MPD foi submetida a fracionamento cromatográfico em cartucho de sílica quimicamente modificada C-18 (Strata Phenomenex®) de 7 cm de altura e 3 cm de diâmetro. Para cada alíquota a eluição foi conduzida utilizando-se 50 mL de misturas de solventes H2O e MeOH em diferentes proporções. As massas dessas
frações estão descritas na Tabela 34 (p. 183).
(9)
Tabela 34 - Rendimento fracionamento cromatográfico de BRF074-MPD
Fração Eluente Sigla Massa Rendimento
1 H2O 100% BRF074-MPD-F1 56,2 mg 11.2% 2 H2O/MeOH 8:2 BRF074-MPD-F2 66,4 mg 13,2% 3 H2O/MeOH 6:4 BRF074-MPD-F3 64,7 mg 12,9% 4 H2O/MeOH 1:1 BRF074-MPD-F4 44,6 mg 8,9% 5 MeOH/H2O 7:3 BRF074-MPD-F5 45,7 mg 9,1% 6 MeOH/H2O 8:2 BRF074-MPD-F6 128,3 mg 25,6% 7 MeOH/H2O 9:1 BRF074-MPD-F7 76,4 mg 15,3% 8 MeOH 100% BRF074-MPD-F8 10,9 mg 2,2% Total 493,2 mg 98,6%
Fonte: Elaborada pelo autor
7.7.3.1 Análises cromatográficas das amostras obtidas no fracionamento do extrato BRF074- MPD
Todas as frações obtidas no fracionamento em cartucho C18 foram submetidas à análise por CLAE, utilizando coluna analítica no modo reverso e gradiente H2O/CH3CN com
a concentração de CH3CN variando de 20% à 80% em 30 minutos, com fluxo de 1 mL.min-1.
A amostra foi injetada na concentração de 1 mg/mL. A partir da análise dos cromatogramas obtidos verificou-se que a fração BRF074-MPD-F6 revelou a presença dos compostos BRF074 (9) e BRF074 (10), isolados anteriormente da fração BRF074-BDL-F6. Um método isocrático foi desenvolvido para a fração BRF074-MPD-F5, que apresentou um perfil cromatográfico diferente dos encontrados nas frações oriundas dos extratos cultivados em meio BD e BDL (BRF074-BD e BRF074-BDL).
7.7.3.2 Fracionamento em CLAE de BRF074-MPD-F5
A fração BRF074-MPD-F5 (45,7 mg) foi submetida à análise por CLAE, utilizando coluna analítica (modo reverso) para desenvolvimento de um método isocrático, para melhor separação dos seus constituintes químicos. Com a amostra na concentração de 1mg.mL-1 e um fluxo de 1 mL.min-1, foi possível chegar a um método isocrático H
2O/MeOH
45:55 onde observou-se boa separação dos picos. Esse método foi reproduzido em uma coluna semi-preparativa, também operado no modo reverso, com fluxo de 4,72 mL.min-1 e
análise mostrou um pico majoritário com tempo de retenção 8,33 min, que após evaporação do solvente forneceu 5,9 mg de um composto codificado BRF074 (11).
Figura 117 - Cromatograma do fracionamento em CLAE de BRF074-MPD-F5
Fonte: Elaborada pelo autor