3.1. Düşüncelerinin Felsefi Boyutu
3.1.1. Bir Filozof olarak Pascal
O extrato LG949-SAHA (550 mg) foi submetido a cromatografia de exclusão utilizando 15,0 g de gel de Sephadex LH-20 em uma coluna de 2,5 cm de diâmetro. Para eluição foram utilizados 200 mL dos eluentes: 1) CH2Cl2/Hex 4:1; 2) CH2Cl2/Acetona 3:2;
3) CH2Cl2/Acetona 1:4; 4) CH2Cl2/MeOH 1:1 e 5) MeOH. As massas dessas frações estão
descritas na Tabela 35 (p. 188).
Tabela 35 - Rendimento fracionamento cromatográfico em Sephadex de LG0949-SAHA
Fração Eluente Sigla Massa Rendimento
1 CH2Cl2/Hex 4:1 LG0949-SAHA-A 269,7 mg 49,0 % 2 CH2Cl2/Acetona 3:2 LG0949-SAHA-B 192,5 mg 35,4 % 3 CH2Cl1:4 2/Acetona LG0949-SAHA-C 26,1 mg 4,7 % 4 CH2Cl2/MeOH 1:1 LG0949-SAHA-D 24,5 mg 4,4 % 5 MeOH LG0949-SAHA-E 1,2 mg 0,2 % Total 514,0 mg 93,7%
Fonte: Elaborada pelo autor
A fração LG0949-SAHA-A (250 mg) foi submetida a fracionamento cromatográfico em coluna de sílica quimicamente modificada C-18 (20,0 g de C18 em coluna de 2,5 cm de diâmetro). Para cada alíquota a eluição foi conduzida utilizando-se 100 mL de misturas de solventes H2O e MeOH em diferentes proporções As massas dessas frações estão
descritas na Tabela 36 (p. 188).
Tabela 36 - Rendimento fracionamento cromatográfico de LG0949-SAHA-A
Fração Eluente Sigla Massa Rendimento
1 H2O 100% LG0949-SAHA-A1 11,4 mg 4,5 % 2 H2O/MeOH 8:2 LG0949-SAHA-A2 28,6 mg 11,5 % 3 H2O/MeOH 6:4 LG0949-SAHA-A3 84,4 mg 33,7 % 4 H2O/MeOH 1:1 LG0949-SAHA-A4 20,9 mg 8,3 % 5 MeOH/H2O 7:3 LG0949-SAHA-A5 25,6 mg 10,3 % 6 MeOH/H2O 8:2 LG0949-SAHA-A6 9,8 mg 3,9 % 7 MeOH/H2O 9:1 LG0949-SAHA-A7 13,6 mg 5,4 % 8 MeOH 100% LG0949-SAHA-A8 11,3 mg 4,6 % Total 205,6 mg 82,2%
7.10.6.1 Fracionamento cromatográfico de LG0949-SAHA-A2
A fração LG0949-SAHA-A2 (27 mg) foi submetida a fracionamento cromatográfico utilizando 750 mg de gel de sílica em uma coluna de 0,5 cm de diâmetro. Para eluição foram utilizados 10 mL da mistura de solventes CH2Cl2/MeOH 98:2. Ao final do
procedimento foram coletadas 20 frações de aproximadamente 0,5 ml de volume e após análise por CCD as frações obtidas foram reunidas de acordo com suas semelhanças em 5 grupos: f1-2, f3, f4-9, f10-14 e f15-20.
A fração 3 (5,0 mg) foi submetida à análise por CLAE, utilizando coluna semi- preparativa de fase reversa e método isocrático MeOH/H2O 30:70 com fluxo de 3 mL.min-1 e
amostra na concentração de 10 mg.mL-1. Foram coletados 2 picos de t
r = 12,0 e 6,5 min, que
após análise por RMN se apresentaram como substancias puras e foram denominadas LG0949 (1) (3,0 mg) e LG0949 (2) (1,6 mg), respectivamente. O cromatograma referente à análise está apresentado na Figura 118 (p. 189).
Figura 118 - Cromatograma do fracionamento em CLAE de LG0949-SAHA-A2-f3
Fonte: Elaborada pelo autor
7.10.6.2 Fracionamento cromatográfico de LG0949-SAHA-A4
A fração LG0949-SAHA-A4 (10,0 mg) foi submetida ao mesmo tratamento cromatográfico que LG0949-SAHA-A2, utilizando sílica de fase normal. Ao final do procedimento 4 frações foram obtidas: f1-2, f3-5, f6-11e f12-20
A fração 3-5 (2,5 mg) após análise por RMN se apresentou como substância pura e foi denominada LG0949 (3).
7.10.6.3 Fracionamento cromatográfico de LG0949-SAHA-A3
A fração LG0949-SAHA-A3 (50 mg) foi submetida à análise por CLAE, utilizando coluna semi-preparativa de fase reversa e método isocrático MeOH/H2O 50:50 com
fluxo de 3 mL.min-1 e amostra na concentração de 20 mg.mL-1. Foram coletados 2 picos, pico
1 (12,1 mg; tr = 8,0 min) e pico 2 (17,3 mg; tr = 12,0 min). Após análise por RMN o pico 2 se
mostrou como uma substancia pura e foi denominado LG0949 (4). O cromatograma referente à análise está apresentado na Figura 119 (p. 190).
Figura 119 - Cromatograma do fracionamento em CLAE de LG0949-SAHA-A3
Fonte: Elaborada pelo autor
7.10.6.4 Fracionamento cromatográfico de LG0949-SAHA-A5
A fração LG0949-SAHA-A5 (10 mg) foi submetida à análise por CLAE, utilizando coluna semi-preparativa de fase reversa e método isocrático MeOH/H2O 70:30 com
fluxo de 3 mL/min e amostra na concentração de 20 mg.mL-1 (FIGURA 120, p. 191). Foram
coletados 4 picos, porém após análise por RMN somente o pico de tr = 18,5 min se mostrou
como uma substância pura e foi denominado LG0949 (5).
Figura 120 - Cromatograma do fracionamento em CLAE de LG0949-SAHA-A5
8 CONCLUSÕES
O estudo de bioprospecção dos metabólitos secundários produzidos pelo fungo marinho Aspergillus niger (cepa BRF074), resultou no isolamento e caracterização estrutural de 11 compostos (ANEXO 1), pertencentes as classes das dicetopiperazinas, pseurotinas, malforminas e sesquiterpenos, e um composto inédito classificado como um derivado ester furânico.
Os constituintes químicos obtidos do cultivo dos extratos AcOEt de A. niger em meio BD - 28 dias foram identificados como sendo: ciclo-(4-hidroxi-L-Pro-L-Leu) BRF074 (1), ciclo-(4-hidroxi-L-Pro-L-Phe) BRF074 (2), ciclo(L-Pro-L-Leu) BRF074 (3), ciclo(L- Pro-L-Phe) BRF074 (4), pseurotina D BRF074 (5), pseurotina A BRF074 (6) e clovalicina BRF074 (7). Do cultivo em meio de cultura BDL - 14 dias foram isoladas os compostos ciclo(L-Pro-L-Tyr) BRF074 (8), malformina A BRF074 (9) e malformina C BRF074 (10). O composto inédito de esqueleto ester furânico BRF074 (11) foi isolado do cultivo de A. niger em MDP - 28 dias. Dentre os metabólitos secundários isolados, apenas as malforminas Ae C já foram relatadas a partir de A. niger.
Todos os compostos puros foram submetidos a testes de atividade citotóxica frente a linhagem de células tumorais de cólon (HCT-116), onde somente o composto inédito BRF074 (11) e as malforminas A BRF074 (9) e C BRF074 (10) se mostraram ativos.
Um estudo envolvendo a quantificação e monitoramento da produção dos compostos ativos BRF074 (9), BRF074 (10) e BRF074 (11) nos diferentes extratos AcOEt de A. niger foi realizado. O método cromatográfico desenvolvido provou ser eficiente nas análises quantitativas destes compostos nos respectivos extratos, quando o micro-organismo foi cultivado sob diferentes condições, como confirmado pelos parâmetros analíticos validados no sistema CLAE-DAD. Os parâmetros de validação avaliados foram: linearidade (coeficiente de correlação > 0,99), precisão (desvio padrão relativo abaixo de 5 %) e exatidão (recuperação > 96 %). A partir deste método, foi observado que os maiores teores das malforminas A e C foram obtidos no meio BDL, nos períodos de 21 e 28 dias, enquanto que o ester furânico foi produzido em maior quantidade no meio MPD em 28 dias.
Visando maximizar a produção de metabólitos secundários por uma única cepa, a técnica de epigenética utilizando o reagente SAHA e a cepa LG0949 levou à produção e isolamento de três lactonas α, -insaturadas, phomalactona (LG0949-1), dihidrophomalactona (LG0949-2) e acetophomalactona (LG0949-3), que não foram produzidas no extrato original sem o reagente SAHA. De forma inusitada, o reagente SAHA foi também biotransformado
pelo micro-organismo produzindo o composto acetanilida (LG0949-4), além de um dímero do reagente (LG0949-5).
Embora já bastante reportado na literatura, o estudo químico de A. niger resultou no isolamento de compostos inéditos no micro-organismo e no gênero Aspergilus, além de um composto de caráter inédito na literatura BRF074 (11), dos quais alguns com atividade citotóxica.
Os resultados obtidos confirmam o potencial de micro-organismos na produção de metabolitos secundários bioativos, e corroboram a influência dos meios nutricionais, período de crescimento e reagentes epigenéticos na obtenção de diferentes metabólitos secundários bioativos.