ISSR yöntemi kullanılarak elde edilen verilen istatistiksel analiz

Bu çalışmada Trakya Bölgesinde doğal olarak yetişen Sinapis sp. popülasyonları ve standart olarak kullanılan popülasyonlardaki genetik çeşitliliğin karakterizasyonu 10 ISSR primeri kullanılarak ISSR yöntemi ile analiz edildi. ISSR, dominant kalıtım gösteren bir DNA işaretleyicisidir. Sinapis sp. popülasyonları ve standart popülasyonlar da diploit bitkilerden meydana geldiğinden, ISSR verileri diploit ve dominant olarak kabul edildi. Bu duruma göre her bir bireye ait bant modeli, mobilite ve bant sayıları değerlendirilerek elde edilen veriler düzenlendi.

PCR ürünlerinin elektroforez yapıldığı jellerin üzerinden ve jel fotoğraflarından skorlama işlemi yapıldı. PCR işlemi sonucunda üretilen bantlar değerlendirilirken, her bir primerin ürettiği, her farklı bant bir lokus olarak kabul edildi. Böylece belirlenen ISSR lokuslarının iki alelli olduğu kabul edildi. Bu aleller, lokusta bant gözlendiğinde (1) gözlenmediğinde ise (0) olarak belirlendi (Şekil 3.8). Tüm popülasyonlara ait PCR ürünleri için elektroforez jellerinin bu şekilde ham verileri elde edildi. Elde edilen ham veriler genetik ile ilgili bazı istatistik analizleri yapmak amacıyla kullanılan POPGENE dosya formatına dönüştürüldü. Verileri dosya formatına dönüştürme işleminden önce tüm popülasyonlara ait bant skorlanması tamamlandıktan sonra, her bir ISSR lokusunda 340 bireyde gözlemlenmiş bant sayılarına bakıldı. Her bir lokusta görülen toplam bant sayısı 10 taneden daha az ise böyle lokuslar istatistiksel değerlendirmenin dışı bırakıldı. Bu bantların PCR hatası sonucunda meydana gelmiş olma ihtimali olduğundan ve çalışma sonuçlarının daha doğru değerlendirilmesi açısından bu şekilde bir yol izlendi.

Şekil 3.8. ISSR yönteminde PCR ürünlerinin istatistiksel analize hazır hale getirilmesi

ISSR yöntemi kullanılarak yapılan moleküler genetik karakterizasyon çalışması kapsamında, popülasyon genetiği analizleri için elde edilen bütün veriler POPGENE 1.32

58

sürüm (Yeh ve ark. 1997) yazılım paketi kullanılarak analiz edildi. Yapılan bu analizlerde popülasyon içi genetik çeşitlilik ve popülasyonlar arası genetik çeşitliliği değerlendirmek amacı ile bazı parametreler kullanıldı. Bu çalışmadaki tüm bireyler için, popülasyon içi ve popülasyonlar arası genetik çeşitliliği (He) hesaplamak için Nei (1973) kullanıldı.

ISSR primerleri ile PCR uygulanan bütün popülasyonlardaki, tüm lokuslara ait ortalama alel sayısı (na) ve ortalama etkili alel sayısı (nea) hesaplandı. Etkili alel sayısı

(Estimates of the reciprocal homozygosity) (Hartl ve Clark 1989) eşit sıklıkta görülen alel sayısı olarak bilinmektedir ve belirli bir düzeyde genetik çeşitliliği hesaplamak için kullanılmaktadır. Etkili alel sayısı aynı zamanda, alellerin sayısı ve dağılımına göre ve önemli ölçüde farklılaşmaya göre popülasyonları karşılaştırma olanağı sağlamaktadır. Bazı istatistikçiler genetik çeşitliliği ve farklılaşmayı ifade etmede daha etkili bir yöntem olduğunu ifade edilmektedir (Jost 2007, 2008).

Değerlendirilen popülasyonların gen havuzlarındaki ortak alel sayısı azaldıkça, bu popülasyonların genetik farklılaşma düzeyleri artmaktadır. Doğada kendiliğinden yetişen ve doğal (yabani) olarak adlandırılan, bütün popülasyon formlarının genetik yapılarının tespit edilmesi, popülasyon genetiğinin en önemli konularından biridir. Bu popülasyonlar ile yapılan moleküler genetik çalışmaların sonuçlarının uygulamalı olarak kullanıldığı çeşitli alanlar bulunmaktadır. Bu alanlar, adli tıp, evrimsel biyoloji, koruma, bitki ve hayvan ıslahı olarak sıralanmaktadır.

Önceleri, popülasyonların genetik yapılarının araştırılmasında en çok kullanılan yöntem olarak FST (Wright 1943a, 1965) bilinmekteydi. Bu yöntemde, Wright F

istatistiklerini (inbreeding coefficient) kendileşme katsayısı olarak kullandı ve Wright, birleşen iki gamet arasındaki korelasyon olarak tanımlandı. Önceki dönemlerde, izoenzim ve diğer moleküler markerler kullanılmadığından, Wright, her bir lokusu bialelik yani iki alelli olarak kabul etmiştir. FST’yi hesaplama işlemini de iki alelli lokuslar üzerinden yapmıştır.

Fakat günümüzde kullanılan marker yöntemleri çok alelli olduğundan bu yöntem genellikle tercih edilmemektedir. Wright’ın istatistik yöntemi yerine Nei (1987)’nin geliştirdiği GST,

Cockerham (1984) ɵp veya Jost D (2008) günümüzde yaygın olarak kullanılmaktadır.

Nei (1987)’nin GST hesaplaması, Wright’in çalışmasının doğrudan açılımı şeklinde

olduğu belirtilmektedir. GST hesaplaması beklenen genetik çeşitlilik (expected heterozygosity)

59

çalışmada, popülasyonlar arası genetik farklılaşma düzeyini belirlemek amacı ile Nei’nin G istatistiği (GST), kullanıldı.

GST= (HT-HS)/ HT= DST/HST (3.2.)

Popülasyonların, gen havuzları arasında, gen transferlerinin meydana gelmesi olayına gen akışı adı verilmektedir. Gen akışı, genellikle tohum transferi, polen transferi vb. bazı yöntemlerle ya da bireylerin göç etmesiyle ortaya çıkmaktadır. Gen akışı, popülasyonlar arasında bulunan genetik farklılaşmayı ölçen GST ya da FST değerlerine göre hesaplanmaktadır.

Bu çalışmada, bütün popülasyonlar arasındaki gen akışı (Nm) değeri, GST’den aşağıdaki

formül kullanılarak hesaplandı. Bu formülde, N, etkili popülasyon büyüklüğünü ve m değeri ise popülasyonlarda göç eden bireylerin oranını temsil etmektedir.

Nm = 0,5 (1-GST)/GST

(3.3.)

Bu çalışmada kullanılan bütün popülasyonlarda ISSR yöntemi ile analiz yapmak için kullanılan 10 primerin ürettiği lokusların, popülasyon düzeyinde ve bütün popülasyonların tamamında gösterdiği polimorfizm oranları manuel olarak hesaplandı. ISSR lokuslarının, popülasyon içindeki (Hs) ve popülasyonların tümünde (HT) gösterdikleri genetik çeşitlilik

değerleri de POPGENE 1.32 istatistik programı kullanılarak belirlendi.

Korelasyon iki ya da daha fazla değişken arasındaki ilişkiyi ve bu ilişkinin önemlilik derecesini belirlemeye yönelik olarak yapılan istatistiksel bir yöntemdir. Bu yöntem, bilimsel çalışma sonuçlarının değerlendirilmesinde sıklıkla kullanılmaktadır. Günümüzde en çok kullanılanlar, Pearson korelasyon katsayısı ile Spearman korelasyon katsayıları olarak bilinmektedir. İki değişken arasındaki korelasyon belirlenirken, bunlardan biri bağımlı değişken iken, diğeri ise bağımsız değişken olarak belirlenmektedir. Korelasyon katsayısı, bağımlı ve bağımsız değişkenler arasındaki ilişki düzeyini hesaplayan ve bu değişkenlik düzeyinin yönünü gösteren sayısal bir değer olarak adlandırılmaktadır. Korelasyon katsayısı, r ile gösterilmektedir ve değeri -1,0 ile +1,0 arasında değişmektedir. Bu çalışmada, genetik çeşitlilik değerleri (He, na ve nea), iklimsel (sıcaklık, yağış ve rüzgar) ve coğrafik veriler

(yükseklik, enlem ve boylam) arasındaki ilişki Pearson’un korelasyon katsayısı (rP)

60

Temel bileşenler analizi, (TBA) (Principal Component Analysis PCA) orijinal p değişkeninin varyans yapısını, değişkenlerin doğrusal bileşenleri olan daha az sayıdaki yeni değişkenlerle ortaya koyan bir yöntem olarak bilinmektedir. Aralarında korelasyon olan p sayıdaki değişkenin ortaya çıkardığı yapıyı, aralarında korelasyon olmayan ve sayıca orijinal değişkenden daha az sayıdaki (p>k) orijinal değişkenlerin, doğrusal bileşenleri olan değişkenlerle ifade etme yöntemi temel bileşenler analizi olarak adlandırılmaktadır. Veri matriksinde bulunan p değişkeninin, doğrusal bileşenlerini bulmak amacıyla kovaryans matriksinin veya korelasyon matriksinin öz değerleri ve öz vektörleri kullanılmaktadır. İncelenen popülasyonların sahip oldukları genetik yapılara ve çevresel bileşenlere göre uzaysal dağılımının görüntülenmesinde kullanılan altarnatif bir yöntemdir. Bu çalışmada XLSTAT versiyonu (2012) kullanıldı. Pearson korelasyon matriksine göre, değişken olarak He, na ve nea ile sıcaklık, yağış, rüzgar, yükseklik, enlem ve boylam verileri kullanılarak TBA yapıldı.

Regresyon analizi, aralarında sebep sonuç ilişkisi bulunan, iki ya da daha fazla değişken arasındaki ilişkiyi belirlemek ve bu ilişkiyi kullanarak o konu ile ilgili tahminlerde bulunmak amacı ile kullanılan bir yöntemdir. Regresyon analizi tek değişkenli ya da çok değişkenli olarak uygulanabilen bir yöntemdir. Tek değişkenli olarak uygulanırsa, bir bağımlı değişken ile bir bağımsız değişken arasındaki ilişki araştırılmaktadır. Çok değişkenli olarak yapılan regresyon analizinde ise bir bağımsız değişken ve birden fazla bağımsız değişken arasındaki ilişki araştırılmaktadır. Regresyon karesi değeri, değişkenler arasındaki ilişkinin düzeyini belirleyen sayısal değer olarak tanımlanmaktadır. Bu çalışmada, genetik veriler ile elde edilen değerler (He, na ve nea) ile eko-coğrafik faktörler (yağış, sıcaklık, rüzgâr,

yükseklik, enlem ve boylam) arasındaki sebep sonuç ilişkisi SPSS 20 sürümü (Windows için olanı) ile belirlendi. Genetik veriler bağımlı değişken olarak değerlendirilirken, eko-coğrafik faktörler ise bağımsız değişken olarak kabul edildi. Öncelikle tekli regresyon analizi yapıldı. Fakat önemli bir sonuç elde edilmediği için çoklu regresyon analizi de uygulandı.

Organizmalar arasındaki filogenetik ilişkilerin ya da genetik benzerliklerinin derecesini gösteren, ağaç dallarına benzeyen şekle dendogram adı verilmektedir. Düşey eksende gösterilen değerler, zamanı veya göreceli gelişme (ilerleme) düzeyini göstermektedir. Bu çalışmada, iki farklı istatistik programı kullanılarak iki dendogram elde edildi. Bunlardan ilki Nei’nin (1972) genetik uzaklık ve genetik benzerlik hesaplarına göre UPGMA (Unweighted Pair-Group Average) yöntemi ile elde edildi. İkinci dendogram XLSTAT

61

versiyon (2012) programı kullanılarak Euclidean uzaklığı ile UPGMA yöntemine göre oluşturuldu.