İkinci Yılki Deneme Materyali Üzerinde SSR Yöntemi İle Moleküler Genetik Analizler

İkinci yıl denemesi olarak, Tesadüf Blokları Deneme Desenine göre dört tekerrürlü yetiştirilen genotiplerin moleküler genetik karakterizasyonu SSR yöntemi ile yapıldı. Deneme tarlasında yetiştirilen 9 genotipve Brassica napus türüne ait iki kanola çeşidi (Excalibul ve Caravel), Sinapis alba türü ve Camelina sativa türünden oluşan kontrollere ait 4 birey olmak üzere toplam 13 birey, 6 SSR primer set (6 reverse ve 6 forward) ile taranmıştır.

SSR yöntemi ile moleküler genetik çalışmalar, Hitit Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Biyoloji Bölümü Öğretim Üyesi Doç. Dr. Özlem ÖZBEK’in laboratuvarı kullanılarak ve kendisinin katkıları ile yapıldı.

3.5.1. SSR analizi için bitki materyalinin elde edilmesi

Namık Kemal Üniversitesi, Ziraat Fakültesi, Tarla Bitkileriana Bilim Dalı’na ait deneme tarlasında, Tesadüf Blokları Deneme Deseni’ne göre 4 tekerrürlü olarak yetiştirilen Sinapis sp. ve standart genotiplerin SSR yönemi ile moleküler genetik karakterizasyonu için gerekli olan bitki materyali tarlada yetiştirilen bitkilerden alındı. Seçilen bitkiler yaklaşık 1- 1,5 aylık gelişimini deneme tarlasında tamamladıktan sonra, yaprakları alınarak birey kodu yazılı ve içinde silika jel bulunduran kaplara alındı. Silika jel kullanılarak bitkinin enzimlerinin çalışması ve DNA yapısının bozulması önlendi. Suyunu tamamen kaybeden

66

bireylere ait yapraklar güneş görmeden kurutuldu. Kurutulan yapraklar, porselen havan yardımı ile toz hale gelene kadar ezildi. Toz haldeki yaprak örnekleri üzerine birey kodu yazılmış plastik tüplerde ve oda sıcaklığında saklandı.

3.5.2. SSR analizi için genomik DNA izolasyonu

SSR yöntemi kullanılarak yapılacak olan moleküler genetik karakterizasyon çalışmalarında kullanılacak olan genomik DNA izolasyonu toz hale getirilmiş kuru yaprak örneği kullanılmasının ve 3. işlem basamağı olan kloroform:izoamilalkol işleminin iki kez tekrarlanması şeklinde modifiye edilerek, ISSR yöntemi için kullanılan genomik DNA izolasyon yöntemi kullanıldı.

Genomik DNA izolasyon işlemi tamamlandıktan sonra elde edilen çözeltide DNA olup olmadığını kontrol etmek için hazırlanan %2’lik agaroz jelde, 100 mV ve 50 mA akım ile elektroforez yapıldı. Elektroforez tamamlandıktan sonra UV ışık altında elde edilen DNA bantları görüntülendi. DNA izolasyonunun %100 başarılı olduğu gözlendi. İzolasyonu yapılan Eppendorf tüplerdeki, genomik DNA’lar +4°C sıcaklıkta buzdolabında SSR işlemi uygulanana kadar saklandı.

3.5.3. SSR analizinde kullanılan primerler

Tesadüf Blokları Deneme Desenine göre yetiştirilen, Sinapis arvensis L., Sinapis nigra L., türlerine ait 9 genotip ve Brassica napus türüne ait iki kanola çeşidi (Excalibul ve Caravel), Sinapis alba türü ve Camelina sativa türünden oluşan 4 standart olmak üzere toplam 13 genotip SSR yöntemi ile değerlendirildi. Forward (ileri) primerleri 5’ tarafından HEX ve FAM olmak üzere iki farklı floresan boya ile işaretlenen 6 SSR primer set (6 reverse ve 6 forward) 13 bireyin her birine uygulandı. Bu çalışmada kullanılan SSR primerlerine ait bilgiler (Suwabe ve ark. 2002) Çizelge 3.14’de gösterilmektedir.

67

Çizelge 3.14. SSR analizinde kullanılan 6 SSR primerinin baz dizileri

Lokus TM Primer dizisi(5′–3′) BFB FB

BRMS-001 (GA)25 GGTGGCTCTAATTCCTCTGA ATCTTTCTCTCACCAACCCC 139 HEX BRMS-005 (GA)13 ACCTCCTGCAGATTCGTGTC GCTGACCTTTCTTACCGCTC 162 HEX BRMS-006 (GA)34 TGGTGGCTTGAGATTAGTTC ACTCGAAGCCTAATGAAAAG 193 HEX BRMS-018 (GA)45 TCCCACGCCTTCTAGCCTTC ACCGGAGCTTTTCTGTTGCC 168 FAM BRMS-031 (TC)33 TGCCACCAATGACAATGACACTATC GATGCACTGGGACCACTTACATTTT 238 FAM BRMS-040 (GA)49 (GT)4 TCGGATTTGCATGTTCCTGACT CCGATACACAACCAGCCAACTC 283 FAM

tekrar motifi (TM), tanıdığı baz dizisi, taşıdığı floresan işareti (FB) ve beklenen fragment boyutu (BFB)

SSR primerleri liyofilize (toz) olarak alındı ve aşağıdaki gibi seyreltme işlemi gerçekleştirildi.

1. Liyofilize haldeki primerlarin içinde bulunduğu tüpler 8000 rpm devirde 30 santrifüj edildi.

2. Primerlerin seyreltilmesi işlemi xnmol X 10 formülüne göre hesaplandı. Buna göre; örneğin, 17,8 nmol primer için, 17,8 nmol x 10µl = 178 nmol olarak hesaplandı. Bu çözeltinin konsantrasyonu 100 µM = 100 pmol/µl’dir.

3. Liyofilize haldeki 17,8 nmol primerin bulunduğu tüpe 178 µl ultra saf su eklendi. Her primerin miktarına göre hesaplamalar yapılarak, uygun miktarlarda ultra saf su eklendi.

4. Ultra saf su eklenen tüpler 8000 rpm devirde 30 sn santrifüj edildi.

5. Elde edilen seyreltilmiş 100 µM konsantrasyonundaki primer stok solüsyon olarak değerlendirildi.

6. Stok solüsyon primerden, steril edilmiş eppendorf tüpe 10 µl alınarak üzerine 90 µl ultra saf su eklenerek 10 µM (10 pmol/µl) konsantrasyondaki primer solüsyonları elde edildi. Seyreltme işleminin tamamı buz üzerinde ve steril laminar kabinde yapıldı.

68 3.5.4. SSR analizinin PCR koşullar

Bu çalışmada daha önceden belirlenmiş 13 bireyin, SSR yöntemi ile moleküler genetik karakterizasyonu için kullanılan PCR koşulları, standart bir PCR reaksiyonunun optimizasyonu ile belirlendi. Yapılan optimizasyon çalışmaları sonunda, optimum PCR reaksiyonu için 30 µl master mix reaksiyon hacmi kullanıldı. Hazırlanan her master mix (30 µl), 1,5 µl kalıp DNA içermektedir ayrıca her bir birey için 2,5 μL 10 X buffer (vivantis), 0,6 μL MgCl2 (50 mM) (vivantis), 0,5 µl F primer (10 µM) , 0,5 µl R primer (10 µM), 0,14 μL

dNTP (vivantis), 0,2 μL Taq DNA polimeraz (500 U/mL) ve 19,06 μL dH2O kullanıldı. PCR

master mix hazırlama işlemlerinin tamamı buz üzerinde gerçekleştirildi.

SSR analizi için yapılan işlemlerde, birbirini takip eden her bir döngü için, optimum sıcaklık koşulları belirlendi. PCR işlemleri Thermo electron thermalcycler marka bir cihazı ile gerçekleştirildi. PCR işlemi için optimum döngü sayısı 28 olarak belirlendi. İlk döngü 94°C’ta (Başlangıç denatürasyonu) beş dakika, başlangıç denatürasyonunu takiben 28 döngü boyunca bir dk. 94°C denatürasyon sıcaklığı, bir dk. 47°C primer bağlanması (farklı primerlerde değişebilir), iki dk. 72 °C zincir uzaması, son döngüde ise PCR ile çoğaltılan ürünlerin tamamının uzaması için 72°C’ta 5 dakika olarak uygulandı (Çizelge 3.15).

Çizelge 3.15. Sinapis sp. ve standart genotiplere uygulanan SSR yönteminde kullanılan PCR reaksiyonu işlem basamakları

S.N Reaksiyon basamağı Sıcaklık Zaman Döngü sayısı 1 Başlangıç denatürasyonu 95°C 5 dk. 28 döngü 2 Denatürasyon 94°C 1 dk. 3 Primer bağlanması 47°C 1 dk. 4 Zincir uzaması 72°C 2 dk. 5 Son döngü, reaksiyon tamamlama 72°C 5 dk.

3.5.5. SSR analizleri için agaroz jelin hazırlanışı

Jel elektroforezinde matriks olarak kullanılan agaroz jeli (%2’lik) hazırlamak için 4 gram toz agaroz (sigma) hassas terazide tartılarak 200 mL 1X TAE eklendi. Hafifçe çalkalanarak 80 °C’ta mikrodalga fırında (Blueline) tamamen homojen bir hal alana kadar ısıtıldı. Fırından çıkarılan sıvı haldeki agaroz jel oda sıcaklığında soğumaya bırakıldı. Agaroz jel çözeltisi yeterince soğuduğunda (yaklaşık 20°C) 4 µl (10mg/mL) etidyum bromür (Sigma)

69

eklendi ve kenarları daha önceden kağıt bantla tamamen kapatılan jel tepsisine döküldü. Agarozun tamamen donması beklendi. Agaroz jel donduğunda jel tepsisindeki bantlar ve kuyucukların oluşması için kullanılan taraklar uzaklaştırılarak elektroforez tankına (ATTO, AE 8450) yerleştirildi. Tank içerisine jel yüzeyinin üzerine çıkacak kadar 1X TAE eklendi. 3.5.6. SSR yönteminde PCR ürünlerinin elektroforez koşulları

SSR yöntemi ile elde edilen PCR ürünlerinin elektroforezde yürütülmesi için agaroz jeldeki kuyulara yüklenmesi gerekmektedir. PCR ürünlerinin büyüklüklerini (bp cinsinden) karşılaştırabilmek için DNA ladder (100 bp, vivantis) kullanıldı. Jeldeki ilk kuyucuğa 5 µl DNA ladder yüklendi. PCR ürünlerinin üretildiği reaksiyonlarının master mix hacmi 30 µl olarak hazırlandı. Bu toplam hacimden 5 µl alınarak, 3 µl örnek yükleme tamponu (LB) ile karıştırılarak jeldeki kuyucuklarasırasıyla yüklendi. Kalan 20 µl hacimdeki PCR ürünleri ise fragment analizi yapılana kadar +4°C’ta buzdolabında saklandı.

PCR ürünleri yüklendikten sonra elektroforez işleminin gerçekleşmesi için güç kaynağı 80 mV, 40 mA akıma ayarlanarak yaklaşık 4 saat işleme devam edildi. Ladder bantları tamamen açıldığında güç kaynağı kapatılarak elektroforez işlemi sonlandırıldı. Tepsiden çıkarılan jel, görüntüleme cihazında UV ışık altında görüntülenerek fotoğraflandı (Şekil 3.10).

Şekil 3.10. PCR ürünlerinin agaroz jelde ve UV ışık altındaki görüntüsü (Gıdık, Çorum 2015) SSR yöntemi kullanılarak yapılan PCR reaksiyonlarının fragment analizi ODTÜ (Orta Doğu Teknik Üniversitesi) Teknokentte bulunan RefGen Gen Araştırmaları ve Biyoteknoloji merkezi tarafından yapıldı. Elde edilen fragment analizi sonuçları olan pikler ABI-Peak Scanner v 1.0 yazılım programı kullanılar fragment boyutları belirlendi ayrıca Popgen 1.32 sürüm istatistik programı kullanılarak veriler değerlendirildi.

70