İşçinin Hakları - İşçinin Hakları ve Borçları

2.2. EVDE HİZMET SÖZLEŞMESİNDE TARAFLARIN HAKLARI VE

2.2.1. İşçinin Hakları ve Borçları

2.2.1.1. İşçinin Hakları

Como foram obtidas quase 50 proteínas homólogas, com uma faixa muito próxima de identidade, score e E-value (Tabelas 5 e 6), foi necessário realizar um estudo estrutural destas macromoléculas para se escolher o melhor molde para a construção do modelo. Para isso, todas as estruturas de tubulina com identidade maior do que 80% em relação à sequência-alvo foram extraídas do PDB, sobrepostas e analisadas. A partir da sobreposição estrutural (Fig. 18), identificou-se o sítio de ligação ocupado pelos ligantes de cada proteína candidata a molde.

A relação destas estruturas aparece na Tabela 7, bem como informações importantes para a escolha do molde, como: presença de ligante e seu respectivo sítio de ligação, resolução da estrutura, R-value e fonte.

Tabela 7 – Relação das struturas experimentais das tubulinas depositadas no PDB Códigoa _Ligante(s) _Sítio(s) Método

exp.b Res. c

(Å) R-value (obs.) Fonte Referência

1ffx - - RX 3,95 0,267 Bos taurus Gigant et al. ₍₂₀₀₀₎

1ia0 Docetaxel Taxol ME 15,00 - Sus scrofa Kikkawa et al. ₍₂₀₀₁₎

1jff Taxol Taxol ME 3,50 - Bos taurus Löwe et al. (2001)

1sa0 Colchicina Colchicina RX 3,58 0,233 Bos taurus Ravelli et al. ₍₂₀₀₄₎

1sa1 Podofilotoxina Colchicina RX 4,20 0,206 Bos taurus Ravelli et al. ₍₂₀₀₄₎

1tub Docetaxel Taxol ME 3,70 - Sus scrofa Nogales, Wolf e _{Downing (1998)}

1tvk Epotilona A Taxol ME 2,89 - Bos taurus Nettles et al. ₍₂₀₀₄₎

1z2b Colchicina _Vimblastina Colchicina _Vimblastina RX 4,10 0,212 Bos taurus Gigant et al. ₍₂₀₀₅₎

2hxf Taxol Taxol ME 10,00 - Sus scrofa Kikkawa e _{Hirokawa (2006)}

2hxh Taxol Taxol ME 11,00 - Sus scrofa Kikkawa e _{Hirokawa (2006)}

2p4n Taxol Taxol ME 9,00 - Bos taurus Sindelar e _{Downing (2007)}

2wbe Taxol Taxol ME 9,40 - Bos taurus Bodey, Kikkawa e _{Moores (2009)}

2xrp - - ME 8,20 - Bos taurus Fourniol et al. ₍₂₀₁₀₎

3dco Taxol Taxol ME 11,00 - Bos taurus Cochran et al. ₍₂₀₀₉₎

3du7 Colchicina _{Fomopsina A} Colchicina _Vimblastina RX 4,10 0,218 Bos taurus Cormier et al. ₍₂₀₀₈₎

3e22 Colchicina _Soblidotina Colchicina _Vimblastina RX 3,80 0,231 Bos taurus Cormier et al. ₍₂₀₀₈₎

3edl Colchicina _Taxol Colchicina _Taxol ME 28,00 - Bos taurus Tan, Rice e Sosa ₍₂₀₀₈₎

3hkb - - RX 3,65 0,216 Ovis aries Dorléans et al. ₍₂₀₀₉₎

3hkc E70 Colchicina RX 3,80 0,206 Ovis aries Dorléans et al. ₍₂₀₀₉₎

Tabela 7 (continuação) – Relação das struturas experimentais das tubulinas depositadas no PDB Códigoa _Ligante(s) _Sítio(s) Método

exp.b Res. c

(Å) R-value (obs.) Fonte Referência

3hke T13 Colchicina RX 3,60 0,209 Ovis aries Dorléans et al. ₍₂₀₀₉₎

3iz0 Taxol Taxol ME 8,60 - Bos taurus Alushin et al. ₍₂₀₁₀₎

3n2g G2N Colchicina RX 4,00 0,211 Ovis aries Barbier et al. ₍₂₀₁₀₎

3n2k K2N Colchicina RX 4,00 0,225 Ovis aries Barbier et al. ₍₂₀₁₀₎

3ryc - - RX 2,10 0,172 Ovis aries

Nawrotek, Knossow e Gigant (2011)

3ryf - - RX 2,52 0,170 Ovis aries

Nawrotek, Knossow e Gigant (2011)

3ryh - - RX 2,80 0,168 Ovis aries

Nawrotek, Knossow e Gigant (2011)

3ryi - - RX 2,40 0,169 Ovis aries

Nawrotek, Knossow e Gigant (2011)

3ut5 Colchicina _{Ustilotoxin D} Colchicina _Vimblastina RX 2,73 0,186 Ovis aries Ranaivoson et al. ₍₂₀₁₂₎

4abo - - ME 8,60 - Sus scrofa Maurer et al. ₍₂₀₁₂₎

4drx - - RX 2,22 0,161 Ovis aries Pecqueur et al. ₍₂₀₁₂₎

4eb6 Vimblastina Vimblastina RX 3,47 0,215 Ovis aries Ranaivoson et al. ₍₂₀₁₂₎

4f61 - - RX 4,17 0,242 Ovis aries Mignot et al. ₍₂₀₁₂₎

4f6r - - RX 2,64 0,178 Ovis aries Mignot et al. ₍₂₀₁₂₎

4i4t Zampanolida Taxol RX 1,80 0,173 Bos taurus Prota et al. (2013a)

4i50 Epotilona A Taxol RX 2,30 0,193 Bos taurus Prota et al. (2013a)

4i55 - - RX 2,20 0,169 Bos taurus Prota et al. (2013a)

Tabela 7 (continuação) – Relação das struturas experimentais das tubulinas depositadas no PDB Códigoa _Ligante(s) _Sítio(s) Método

exp.b Res. c

(Å) R-value (obs.) Fonte Referência

4iij - - RX 2,60 0,199 Bos taurus Prota et al. (2013b)

4o2a BAL27862 Colchicina RX 2,50 0,196 Bos taurus Prota et al. (2014a)

4o2b Colchicina Colchicina RX 2,30 0,183 Bos taurus Prota et al. _(2014a)

4o4h Laulimalida Único RX 2,10 0,194 Bos taurus Prota et al. (2014b)

4o4i Laulimalida _{Epotilona A} Único _Taxol RX 2,40 0,190 Bos taurus Prota et al. (2014b)

4o4j Pelorusida A Único RX 2,20 0,203 Bos taurus Prota et al. (2014b)

4o4l Pelorusida A _{Epotilona A} Único _Taxol RX 2,20 0,188 Bos taurus Prota et al. (2014b)

4tuy Rizoxina Único RX 2,10 0,186 Bos taurus Prota et al. (2014c)

4tv8 Maitansina Único RX 2,10 0,191 Bos taurus Prota et al. (2014c)

4tv9 PM060184 Único RX 2,00 0,182 Bos taurus Prota et al. (2014c) a_{Código da estrutura no PDB.}

b_{Método experimental para obtenção da estrutura tridimensional: difração de Raios X (RX) ou microscopia}

eletrônica (ME);

c_{Resolução da estrutura.}

O primeiro item analisado para a escolha da tubulina-molde para o trabalho de modelagem foi a presença de ligantes na proteína. Para a composição da Tabela 7, foram considerados como “ligantes” apenas os inibidores da tubulina, excluindo, portanto, moléculas como o GDP, GTP e outros compostos oriundos do processo de cristalização. Foi observado, por meio da sobreposição estrutural, que a maioria destes ligantes ocupa um dos três sítios de ligação conhecidos para a tubulina: sítio do taxol, da colchicina ou da vimblastina (Fig. 18). Sete ligantes, no entanto, encaixam-se em regiões diferentes da proteína, as quais foram tratadas como “sítio único” (Tabela 7).

Segundo Fiser e Šali (2003), o critério para se selecionar um molde deve estar relacionado com o objetivo do modelo: se o objetivo for construir um modelo proteína-ligante, por exemplo, a escolha de um molde que contenha um ligante similar é, possivelmente, mais importante do que a própria resolução da estrutura. Grinter e Zou (2014) também sugerem que selecionar um molde baseado na ocupação do ligante no sítio de interesse pode produzir um modelo mais adequado para estudos de docking do que escolher baseado apenas na identidade sequencial. Com base neste critério, mantiveram-se como candidatas a molde apenas as estruturas de tubulina experimentais contendo ligantes complexados ao sítio da colchicina (Tabela 7) – sítio onde será realizado o docking molecular das lignanas ariltetralônicas neste trabalho.

Com relação à qualidade estrutural, a resolução e o R-value das proteínas também foram itens considerados para a seleção do molde. Cada estrutura experimental apresenta uma

resolução, que é uma medida da qualidade dos dados coletados do cristal da proteína. Estruturas com resolução igual ou superior a 3 Å são consideradas de baixa resolução. Como regra geral, quanto menor este valor, mais confiável é a localização dos átomos na estrutura. Para cada estrutura determinada por difração de Raios X também há um R-value associado. O R-value é a medida da qualidade do modelo atômico obtido a partir dos dados cristalográficos: um grupo totalmente aleatório de átomos gera um R-value de cerca de 0,63, enquanto que um resultado “perfeito” geraria um valor de 0; normalmente, estes valores são aproximadamente 0,20. Sendo assim, dentre as tubulinas contendo ligantes no sítio da colchicina, considerou-se aquelas que apresentavam menores valores de resolução e R-value.

O último item analisado para a escolha do molde foi a fonte das tubulinas. Foram obtidas proteínas de três organismos diferentes: boi (Bos taurus), javali (Sus scrofa) e ovelha (Ovis aries). A fim de se verificar as diferenças sequenciais entre as proteínas destes mamíferos, foi realizado o alinhamento múltiplo entre as sequências FASTA das cadeias α e β de cada organismo. Para fins de comparação, as sequências da tubulina do P. falciparum e humana foram incluídas nesses alinhamentos (Figs. 19 e 20). Como resultado, pode-se observar que não há uma diferença significativa entre as sequências de boi, javali ou ovelha, de modo que a fonte da tubulina, portanto, não foi adotada como um critério para seleção do molde.

Por possuir um ligante complexado no sítio de interesse – colchicina ligada no sítio da colchicina – e, além disso, apresentar características estruturais (resolução e R-value) mais adequadas do que as demais tubulinas com ligantes no mesmo sítio, a estrutura 4o2b (PROTA et al., 2014a), em destaque na Tabela 7, foi a selecionada como molde para a modelagem por homologia da tubulina do P. falciparum. A 4o2b corresponde à estrutura tridimensional da tubulina bovina (Bos taurus) determinada por difração de Raios X, com resolução de 2,30 Å.

Figura 19 – Alinhamento múltiplo, feito utilizando o Clustal Omega (CLUSTAL OMEGA, s.d.), entre as cadeias α das tubulinas do P. falciparum (Q6ZLZ9 no UniProt), humana (P68366 no UniProt), de boi (4O2B no PDB), de

ovelha (3UT5 no PDB) e de javali (4ABO no PDB). Os asteriscos (“*”) indicam posições onde há resíduos totalmente conservados; dois-pontos (“:”) indicam a conservação entre grupos de propriedades fortemente similares;

Figura 20 – Alinhamento múltiplo, feito utilizando o Clustal Omega (CLUSTAL OMEGA, s.d.), entre as cadeias β das tubulinas do P. falciparum (Q7KQL5 no UniProt), humana (P04350 no UniProt), de boi (4O2B no PDB), de

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