asidle karıştırıldıktan sonra konsantre sülfürik asidle tabakalaştırılmalarında temas yerinde
menekşe renkli bir halka oluşmasıdır.
6.2.5. Amino asidlerin tüm gruplarıyla verdikleri reaksiyon
Amino asidler, Fe2+, Cu2+, Co2+, Mn2+ gibi ağır metallerle kelatlanma kompleks bileşikleri oluştururlar.
6.3. Amino Asidleri Tanımlama Deneyleri
6.3.1. Amino asidleri Van Slyke yöntemi ile tanımlama deneyi
Prensip: Amino asidler, nitröz asid ile reaksiyona girerek stabil olmayan diazo bileşiği üzerinden, azot gazı çıkışıyla α-hidroksi asid oluştururlar.
Gerekenler: 1) %0,5’lik glisin çözeltisi. 2) NaNO2’in %10’luk taze çözeltisi. 3) 2N asetik asid. 4) Pipet 5) Deney tüpleri.
Uygulama: 1) Bir deney tüpüne 2 mL %10’luk NaNO2 çözeltisi konur. 2) Tüpteki
NaNO2 çözeltisi üzerine 2 mL 2N asetik asid eklenir ve karıştırılır. 3) Tüpteki karışım üzerine
%0,5’lik glisin çözeltisi eklenir ve tüp çalkalanmadan iç yüzeyinde gaz kabarcıkları oluştuğu gözlenir.
Açıklama: Deneyin ilk aşamasında NaNO2 ile asetik asidin etkileşmesinden nitröz asid (HNO2) oluşur. Daha sonra nitröz asid, amino asid ile reaksiyonlaşır; amino asiddeki serbest amino (−NH2) grubundan azot gazı meydana gelirken α-hidroksi asid oluşur. Deney tüpünün iç yüzeyinde gözlenen gaz kabarcıkları, açığa çıkan azot gazına aittir. Çıkan azot gazı miktarı ölçülerek çözeltide kaç molekül amino asid olduğu da saptanabilir; bu, amino asidlerin kantitatif tayininde kullanılmaktadır.
6.3.2. Amino asidleri ninhidrin yöntemi ile tanımlama deneyi
Prensip: Amino asidler, amino ve karboksil gruplarının birlikte verdikleri bir reaksiyonda ninhidrin ile mor renkli kompleks oluştururlar.
Gerekenler: 1) %0,5’lik glisin çözeltisi. 2) Ninhidrin reaktifi. 3) Pipet 4) Deney tüpleri. 5) Bunzen beki alevi.
Uygulama: 1) Bir deney tüpüne 1 mL %0,5’lik glisin çözeltisi konur. 2) Tüpteki glisin
çözeltisi üzerine 2 damla ninhidrin reaktifi damlatılır. 3) Tüp, küçük bir alev üzerinde
dikkatlice ısıtılır. 4) Tüpteki karışımın mor bir renk aldığı gözlenir.
Açıklama: Ninhidrin, güçlü bir organik oksidandır. Amino asidler, ninhidrin etkisiyle oksidatif deaminasyona ve dekarboksilasyona uğrarlar; amino asidden aldehid, amonyak ve karbondioksit oluşurken ninhidrin de indirgenir. İlk sıralarda oluşan indirgenmiş ninhidrin de henüz indirgenmemiş ninhidrin ve amonyak ile reaksiyona girerek mor renkli bir kompleks oluşturur; tüpte gözlenen mor renk, oluşan bu mor renkli kompleksten ileri gelmektedir.
Tartışma: Bütün amino asidler ninhidrin ile tepkime verirler; ninhidrin tepkimesi, amino asidlerin kalitatif ve kantitatif tayinlerinde kullanılır.
Amino grubu değil de imino grubu içeren prolin ve hidroksiprolin de ninhidrin ile tepkimeye girerler; fakat oluşturdukları kompleks mor değil sarıdır.
Amino grubu içeren bazı fosfolipidler ve polipeptidler de ninhidrin ile tepkimeye girerler; fakat bu sırada karbondioksit çıkışı olmaz.
6.3.3. Amino asidleri ksantoprotein yöntemi ile tanımlama deneyi
Prensip: Fenil halkası içeren amino asidler, fenil halkasına nitro gruplarının girmesiyle sarı renkli bileşikler oluştururlar.
Gerekenler: 1) Seyreltik serum. 2) Konsantre HNO3 3) %40’lık NaOH 4) Pipet 5) Deney tüpleri. 6) Bunzen beki alevi.
Uygulama: 1) Bir deney tüpüne 1 mL seyreltik serum konur. 2) Tüpteki seyreltik
serum üzerine 1-2 damla konsantre HNO3 damlatılır; tüpte beyaz bir çökelti oluşumu gözlenir. 3) Tüp, küçük bir alev üzerinde dikkatlice ısıtılır; bu sırada çökeltinin sarıya
dönüştüğü ve çözünerek kaybolduğu gözlenir. 4) Tüp soğutulur ve içindeki karışıma 3-4
damla NaOH damlatılır; karışımın renginin turuncuya dönüştüğü gözlenir.
Açıklama: Deney sırasında önce serumda bulunan proteinler HNO3 etkisiyle denatüre olarak çökmektedirler. Isıtma sırasında proteinlerde bulunan ve aromatik halka içeren fenil alanin, tirozin triptofan amino asidleri ayrılırken bunlardaki aromatik halkaya nitro grubu bağlanır ve suda çözünen, sarı renkli bileşik oluşur. Daha sonra ortamın NaOH ile alkalileşmesi sonucunda nitro ucuna sodyum da bağlanır ve kırmızı renkli bileşik oluşur.
Tartışma: Proteinlerin çoğu, fenil alanin, tirozin ve triptofan amino asidlerini içerirler; ksantoprotein reaksiyonunu verirler. Cilde HNO3 teması sonrasında temas yerinde sararma olması ksantoprotein reaksiyonu sonucudur.
6.3.4. Amino asidleri kurşun asetat yöntemi ile tanımlama deneyi
Prensip: Sülfhidril (−SH) veya disülfid (−S−S−) grubu içeren amino asidlerdeki sülfhidril (−SH) ve disülfid (−S−S−) grupları, NaOH ile kaynatma sırasında Na2S veya H2S şeklinde ayrılır; bunlar da kurşun asetat ile siyah renkli PbS oluştururlar.
Gerekenler: 1) Seyreltik serum. 2) %40’lık NaOH 3) Kurşun asetat çözeltisi. 4) Pipet 5) Deney tüpleri. 6) Bunzen beki alevi.
Uygulama: 1) Bir deney tüpüne 2 mL seyreltik serum konur. 2) Tüpteki seyreltik
Tüp, küçük bir alev üzerinde dikkatlice ısıtılır; bu sırada tüpte siyah renkli bir bulanıklık oluştuğu gözlenir.
Açıklama: Sistein ve sistin gibi amino asidleri içeren proteinler, kuvvetli alkali ile ısıtma sonucu hidroliz olurlar ve amino asidlerdeki kükürt, Na2S veya H2S şeklinde ayrılırlar. Ortama kurşun asetat çözeltisi eklendiğinde, kurşun asetat ile Na2S veya H2S’ün tepkimesi sonucunda PbS oluşur. PbS, suda çözünmeyen siyah renkli bir maddedir; tüpte gözlenen siyah renkli bulanıklık, oluşan PbS’den ileri gelmektedir.
Tartışma: Bu deney, sülfhidril (−SH) veya disülfid (−S−S−) grubu içeren amino asidler içindir; içerdiği kükürt sülfhidril (−SH) veya disülfid (−S−S−) şeklinde olmayan metionin ile PbS oluşumu gözlenmez.
6.3.5. Sistein amino asidini sodyum nitroprussiyat ile tanımlama deneyi
Prensip: Sülfhidril (−SH) grubu içeren sistein, serbest sülfhidril (−SH) grubu vasıtasıyla ağır metallerle ve nitroprussiyatla labil, fakat koyu bir renk kompleksi oluşturur.
Gerekenler: 1) Sistein çözeltisi. 2) %40’lık NaOH 3) Sodyum nitroprussiyat çözeltisi. 4) Pipet 5) Deney tüpleri.
Uygulama: 1) Bir deney tüpüne 2 mL sistein çözeltisi konur. 2) Tüpteki sistein
çözeltisi üzerine 1 mL %40’lık NaOH ve 1 mL sodyum nitroprussiyat çözeltisi eklenip karıştırılır. 3) Tüpteki karışımın kırmızı-mor-siyah koyu bir renk aldığı gözlenir.
Açıklama: Sistein, içerdiği serbest sülfhidril (−SH) grubu nedeniyle ağır metallerle ve nitroprussiyatla labil, fakat koyu bir renk kompleksi oluşturur.
Tartışma: Bu deney, sülfhidril (−SH) grubu içeren sistein içindir; içerdiği kükürt sülfhidril (−SH) şeklinde olmayan metionin ve sistin ile negatif sonuç verir.
6.3.6. Fenol içeren amino asidleri Millon yöntemi ile tanımlama deneyi
Prensip: Cıva ve nitro gruplarının fenol içeren amino asidlerdeki fenol grubuna bağlanmasıyla kırmızı renkli cıva-nitro tuzu oluşur.
Gerekenler:1) Tirozin çözeltisi. 2) Millon reaktifi: Konsantre nitrik asid ve cıva nitrat karışımı. 3) Pipet 4) Deney tüpleri. 5) Bunzen beki alevi.
Uygulama: 1) Bir deney tüpüne 1 mL tirozin çözeltisi konur. 2) Tüpteki tirozin
çözeltisi üzerine 1 mL su ve 1 mL Millon reaktifi eklenip karıştırılır. 3) Tüp, küçük bir alev
üzerinde dikkatlice ısıtılır; bu sırada tüpte kırmızı bir renk oluştuğu gözlenir.
Açıklama: Tirozin amino asidi, fenol grubu içermektedir. Tirozin cıva nitrat ve konsantre nitrik asid ile ısıtıldığında cıva ve nitro gruplarının fenol grubuna bağlanmasıyla kırmızı renkli cıva-nitro tuzu oluşur. Tüpte gözlenen kırmızı renk, oluşan cıva-nitro tuzundan ileri gelmektedir.