GEREÇ VE YÖNTEM

Çalışmaya Aralık 2009 – Ocak 2011 tarihleri arasında Dicle Üniversitesi Tıp Fakültesi Araştırma ve Uygulama Hastanesi iç hastalıkları klinikleri, kardiyoloji kliniği, göğüs hastalıkları kliniği ve nöroloji kliniklerinde takip edilen 45 yaşından küçük akut arteriyel tromboz ve akut venöz tromboz tanısı alan toplam 116 (47erkek/69 kadın) hasta ve 104 sağlıklı birey dahil edildi. Akut trombozlu hastalar Diyarbakır ve çevresinden gelen kişilerden oluşmaktaydı.

Hastaların tanıları klinik olarak konulduktan sonra çeşitli görüntüleme yöntemleri ile doğrulandı. Akut koroner sendromlu hastalar Koroner anjiografi ile, pulmoner emboli tanısı ventilasyon–perfüzyon sintigrafisi ve toraks tomografisi ile, derin ven trombozu tanısı alt ekstremide doppler ultrasonografi, portal ven trombozu tanısı abdominal computorize tomografi ve abdominal ultrasonografi ile serebral infarkt magnetik rezonans görüntüleme ve kranial tomografi ile konuldu. Hastalar Akut koroner sendrom (21 hasta, 17E/4K), pulmoner tromboemboli (25 hasta, 5E/20K), derin ven trombozu (14 hasta, 6E/8K), iskemik serebral infarkt (21 hasta, 6E/15K), sinüs ven trombozu (12 hasta, 2E/10K) ve portal ven trombozu (23 hasta, 11E/12K) şeklinde gruplandırıldı. Splenik ven ve hepatik ven tromboz tanılı beş hasta da portal ven trombozu içine dahil edildi. Hastalar arteriyel tromboz ve venoz tromboz şeklinde iki grup şeklinde gruplandırıldı. Akut koroner sendrom ve serebral infark arteriyel grup olarak, derin ven trombozu, portal ven trombozu, sinüs ven trombozu ve pulmoner emboli venöz tromboz grubu olarak kabul edildi.

Hastaların kendilerinden ve/veya yakınlarından anamnez ve özgeçmişleri sorgulandı. Ailede geçirilmiş inme, koroner arter hastalığı, ven trombozu öyküsü ve risk faktörleri sorgulandı. Oral kontraseptif kullanımı, immobilite, geçirilmiş major cerrahi, gebelik ve postpartum dönem akut tromboz için major risk faktörü olarak alındı.

Hastalardan venöz kan örnekleri alınarak lipid profilleri çalışıldı. Total kolesterol, HDL kolesterol ve LDL kolesterole özgü Thermo kitleriyle Konelab 60I® cihazıyla (Thermo Clinical Labsystem®) çalışıldı. Total kolesterol için referans aralığı70–220 mg/dl, HDL kolesterol için30–70 mg/dl, LDL kolesterol için 60–170 mg/dl alındı.

Genetik polimorfizm tespit amaçlı EDTA‟lı tüpe 2ml venöz kan örneği alındı. EDTA‟lı tüplere alınan kan örneği, Roche-Magna Pure Compact otomatik DNA izolasyon cihazında hazır izolasyon kiti ile DNA izolasyonu yapıldı.

Real Time PCR Aşaması:

PCR miskinin hazırlanması:

1. H2O 7,4μL 2. MgCl2 1,6 μL 3. Reaktif miks(prob ve primer karışımı) 4 μL 4.Roche Master hibridizasyon probu 2 μL

Toplam 15 μL

15 μL miks, kapiller tüpe alındı ve üzerine daha önceden elde edilen 5 μL DNA solüsyonu eklendi. Master miks ve DNA karışımının kapiller tüpün dibine çökmesi için santrifüj işlemi yapıldı. Örnekler Light Cycler 2.0 cihazında yürütüldü. 4G ve 5G polimorfizmleri daha önce tanımlanmış primerler kullanılarak amplifiye edildi. Elde edilen amplifikasyon ürünleri TIB Molbiol Light-Mix Kit Human kullanılarak değerlendirildi.

Verilerin yorumlanması

Melting curve (erime eğrisi) kullanılarak örnekler pik yaptıkları sıcaklık derecelerine göre adlandırıldı. 54.5 derecede pik yapan örnekler 4G/4G; 54.5 ve 62.0 derecede pik yapan örnekler 4G/5G; 62.0 derecede pik yapan örnekler 5G/5G olarak adlandırıldı. Homozigot örneklerde tek pik heterozigot örneklerde ise iki pik gözlenmiş oldu.

3.3. Ġstatistiksel Yöntemler

Çalışmada elde edilen sonuçların istatistiksel analizleri SPSS (statistical package for social sciences) for Windows 16.0 programı kullanılarak yapıldı. Bağımlı değişkenlerin belirlenmesinde chi-square testi kullanıldı. Veriler ortalama değer ± SD olarak gösterildi. Sonuçlar % 95 güven aralığında, p < 0.05 standart sapma düzeyinde kabul edildi.

4. BULGULAR

Çalışmaya 45 yaş altı 116 hasta ﴾yaş 34± 7(ortalama ±SD)﴿, 104 kişiden﴾yaş 33±12(ortalama ± SD)﴿ oluşan sağlıklı kontrol grubu dahil edildi. Bir DVT hastasında (gebelik), beş PTE hastasında (gebelik, postpartum, diz operasyonu, femur fraktürü, OKS kullanımı), iki CE hastasında (gebelik, postpartum), altı SVT hastasında(gebelik, immobilite, postpartum) risk faktörü mevcuttu.

Çalışmaya alınan hastalar kontrol grubu ile karşılaştırıldığında yaş açısında bir fark gözlenmezken Total kolesterol, LDL-kolesterol ve trigliserid değerleri hasta grubunda anlamlı olarak daha fazla olduğu görüldü (Tablo 7).

Tablo 7: Çalışmaya alınan hasta ve kontrol grubunun demografik özellikleri

DeğiĢkenler Hasta Kontrol p

yaş 34±7 33±12 0.6 Cinsiyet(E/K) 47/69 38/66 0.58 Total kolesterol 187±52 172±37 0.015 LDL-kolesterol 114±32 97±25 <0.0001 Trigliserid 179±145 122±75 <0.0001 Trombosit 255±93 255±68 0.9

Ortalama trombosit hacmi 8.08±1.4 8.02±1.0 0.7

Çalışmaya alınan hastaların tanılarına göre dağılımı tablo 8„de gösterilmiştir. Hastaların %21.6‟ sında pulmoner emboli, %19.8‟inde portal ven trombozu, %18‟inde akut koroner sendrom, %18.‟ inde serebral infarkt, %12.1‟inde derin ven trombozu ve 10.3‟ünde sinüs ven trombozu olduğu görüldü. Hastalar tanılara göre dağılımı yapıldığında en fazla pulmoner emboli, en az olarak sinüs ven trombozu mevcuttu.

Tablo 8: Çalışma hastalarının tanılarına göre dağılımı

DeğiĢkenler n(%)

Akut koroner sendrom 21 (18.1)

Derin ven trombozu 14 (12.1)

Serebral infarktüs 21 (18.1)

Portal ven trombozu 23 (19.8)

Çalışmaya dahil edilen akut trombozlu hastaların %53.4‟ ünde 4G/5G, %19.8‟ inde 4G/4G ve 26.7‟inde 5G/5G polimorfizmi saptandı. Kontrol grubunda ise % 42.3‟ünde 4G/5G, %18.3‟ ünde 4G/4G ve %39.4‟ ünde 5G/5G polimorfizmi mevcuttu (Tablo 9). Hem hasta grubunda hem de kontrol grubunda 4G/5G polimorfizm en fazla idi. Ancak fark istatistiksel olarak anlamlı değildi. Çalışmaya alınan hastalar 4G allel taşıyıcılığı açısından kontrol grubu ile karşılaştırıldığında, 4G allel taşıyıcılığı hasta grubunda anlamlı olarak daha fazla olduğu görüldü (p=0.046) (tablo 10).

Tablo 9: Çalışma ve kontrol grubunun PAI polimorfizminine göre dağılımı

DeğiĢkenler Hasta n(%) Kontrol n(%) p 4G/5G 62 (53.4) 44 (42.3) 0.12 4G/4G 23 (19.8) 19 (18.3) 0.13 5G/5G 31 (26.7) 41 (39.4) 0.054

Tablo 10: Çalışmaya alınan tüm bireylerin 4G alel taşıyıcılığına göre dağılımı DeğiĢkenler Hasta n(%) Kontrol n(%) p 4G(+) 85 (73.2) 63 (60.5) 0.046 4G(-) 31 (26.8) 41 (39.5) 0.063

Akut trombozlu hastalarda hem arteriyal hem de venöz tromboz gruplarında en fazla 4G/5G polimorfizmi olduğu görüldü (Tablo 11). Ancak akut trombozlu hastalar PAİ polimorfizmi açısından karşılaştırıldığında gruplar arasında herhangi bir fark bulunmadı. Hastalar 4G alel taşıyıcılığı açısında karşılaştırıldığından, 4G allel taşıyıcılığı en fazla pulmoner emboli hastalarında olduğu görüldü. Fark istatistiksel olarak anlamlı bulundu. (p: 0.046) (Tablo 12).

Akut koroner sendrom nedeni ile çalışmaya dahil edilen hastaların % 42.8‟i nde 4G/5G, % 23.8‟ inde 4G/4G, ve % 33.3‟ ünde 5G/5G genotipi mevcuttu. Ayrıca akut koroner sendromlu hastaların % 66.6‟ inde 4G allel taşıyıcılığı mevcuttu (tablo 8). Derin ven tromboz tanılı hastaların %50‟inde 4G/5G, %7.1‟ inde 4G/4G, ve

%42.8‟inde 5G/5G genotipi saptandı. Bu hastaların % 57.1‟ inde 4G allel taşıyıcılığı mevcuttu. Serebral enfarkt tanılı hastaların %61.9‟ünde 4G/5G , %19.0‟ünde 4G/4G , %19.0 5G/5G genotip ve 4G allel sıklığı ise % 80.9 olarak saptandı. Portal ven trombozu olan 23 hastanın % 56.5‟ inde 4G/5G % 21.7‟sinde 4G/4G ve %21.7‟sinde 5G/5G genotip saptandı. Portal ven trombozlu hastaların % 78.4‟ ünde 4G allel taşıyıcılığı mevcuttu. Sinüs ven trombozu tanılı hastaların%33.3‟ ünde 4G/5G , %16.6‟sında 4G/4G , %50‟sinde 5G/5G genotip saptandı ve 4G allel sıklığı ise % 50 olarak bulundu. Pulmoner tromboemboli tanılı 25 hastanın %68‟inde 4G/5G, %24‟ ünde 4G/4G ve % 8‟inde 5G/5G genotip bulundu. Pulmoner emboli nedeni ile çalışmaya dahil edilen hastaların % 92‟sinde 4G allel taşıyıcılığı olduğu görüldü. Bu hasta alt grubunda 4G allel taşıyıcılığı anlamlı olarak daha fazla olduğu görüldü.

Tablo 11: Akut trombozlu hastaların PAİ polimorfizmine göre dağılımı

DeğiĢkenler 4G/5G n(%) 4G/4G n(%) 5G/5G n(%) p Akut koroner sendrom 9 (42.8) 5 (23.8) 7 (33.3) 0.3

Derin ven trombozu 7 (50) 1 (7.1) 6 (42.8) 0.2

Serebral infark 13 (61.9) 4 (19.04) 4 (19.04) 0.7

Portal ven trombozu 13 (56.5) 5 (21.7) 5 (21.7) 0.4

Sinüs ven trombozu 4 (33.3) 2 (16.6) 6 (50) 0.12

Pulmoner emboli 17(68) 6 (24) 2 (8) 0.09

Tablo 12: Akut trombozlu hastaların 4G allel taşıyıcılığına göre dağılımı

DeğiĢkenler 4G(+)

n(%)

4G(-) n(%)

p

Akut koroner sendrom 14 (66.6) 7 (33.4) 0.43

Derin ven trombozu 8 (57.1) 6 (42.9) 0.08

Serebral infarkt 17 (80.9) 4 (19.1) 0.48

Portal ven trombozu 18 (78.2) 5 (21.8) 0.61

Sinüs ven trombozu 6 (50) 6 (50) 0.1

Hastalar arteriyel tromboz ve venöz tromboz olan hastalar şeklinde iki ayrı grup şeklinde tekrar gruplandırıldı. Arteriyal trombozu olan 21 hastanın %50‟inde 4G/5G ,%21.4‟ ünde 4G/4G ve %28.5‟inde 5G/5G genotipi mevcuttu. Arteriyal trombozlu hastalarda 4G allel taşıyıcılığı % 71.4 idi. Venöz trombozlu 41 hastanın %55.4‟ünde 4G/5G , %18.9‟ünda 4G/4G ve%25.6‟sinda 5G/5G genotipi mevcuttu. Venöz trombozlu hastalarda 4G allel sıklığı ise % 74.3 olarak bulundu. Hem arteriyel trombozlu hastalar hem de venöz trombozlu hastalar genotip dağılımı ve 4G allel taşıyıcılığı açısından istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulunmadı (Tablo 13-14).

Tablo 13: Arteriyel ve venöz trombozlarda polimorfizm dağılımı

DeğiĢkenler 4G/5G n(%) 4G/4G n(%) 5G/5G n(%) p Arteriyal tromboz 21(50) 9(21.4) 12(28.5) 0.85 Venöz tromboz 41(55.4) 14(18.9) 19(25.6) 0.85

Tablo 14: Arteriyel ve venöz trombozlarda 4G allel taşıyıcılığı yaygınlığı

DeğiĢkenler 4G(+) n(%) 4G(-) n(%) p Arteriyal tromboz 30 (71.4) 12 (28.6) 0.8 Venöz tromboz 55 (74.3) 19 (25.7) 0.8