A.3.1. SİTOGENETİK İNCELEMELER
Sitogenetik, kromozomların işlev ve morfolojilerini mitotik/mayotik metafaz sürecinde inceleyen bilim dalıdır. Genetik materyalin hücresel düzeyde incelenmesidir. Amaç, kromozomal evreye girmiş olan DNA’da meydana gelen yapısal değişiklikleri (translokasyon, delesyon, insersiyon, inversiyon, duplikasyon gibi) ve köken farklılıklarını (mozaisizm, kimerizm) saptamak, elde edilen sonuç ile fenotipik yapı ve genetik yapı arasındaki ilişkiyi değerlendirmektir (27).
Klasik sitogenetik tanı yöntemlerinde kromozom eldesi için, spontan bölünme hızı yüksek olan hücrelerden sitogenetik çalışma yapılır. Bölünme hızı düşük hücreler ise önce kültüre edilerek yapay uyarıcılar ile mitoz bölünmeye sokulur, çoğaltılır ve daha sonra sitogenetik çalışmalar için kullanılır. Bir fiksatif solüsyon (örneğin formol) içerisinde bulunan dokular kromozom elde etmek için uygun dokular değildir.
Özelleşmiş sitogenetik tanı yöntemleri; spesifik durumlar, bazı kromozomal hastalıkların tanısı veya mutajenite testi için kullanılmak üzere geliştirilmiş özelleşmiş tekniklerdir. Kardeş kromatid değişimi (SCE); metafaz kromozomlarında morfoloji değişmeksizin, özdeş segmentlerin simetrik değişimi sonucu kromatidlerin karşılıklı farklı boyanması ile gerçekleştirilir. Mutajen veya karsinojenlerin oluşturduğu genetik hasarın gösterilmesinde ve kromozom kırığı sendromlarını değerlendirmek amacı ile kullanılır. Mikronükleus tekniği ve frajil bölge tespiti de diğer özelleşmiş sitogenetik yöntemlerdendir (28).
A.3.2. MOLEKÜLER SİTOGENETİK İNCELEMELER
Flow sitometri olarak adlandırılan yöntemle kromozomların analizinde iki lazerli floresan aktive edici hücre sayacı (FACS) kullanılmaktadır. Adenin-timinden zengin bölgeler ve guanin-sitozinden zengin bölgeler ayrı ayrı boyanır, kromozomlar flow sitometrinin ışık demetinden geçirilmek sureti ile analiz edilir (29).
Genomda istenilen DNA bölgesinin floresan veren DNA ve RNA probları ile boyanarak ‘in situ’ olarak gözlenmesine imkan tanıyan moleküler sitogenetik yöntem ise Floresan in situ Hibridizasyondur (FISH). İnterfaz hücre çekirdeğinin ve metafaz kromozomlarının değerlendirilmesini sağlar. Klinikte sayısal ve yapısal anomalilerin, mikrodelesyon sendromları, translokasyonların, marker kromozomların tanınmasını, tümör gelişimi ile ortaya çıkan anomalilerin tanınmasını sağlayan ve gen haritalamada kullanılan bir tekniktir (30).
A.3.3. MOLEKÜLER GENETİK İNCELEMELER
İnsan genom projesi kapsamında yapılan çalışmalar sonucu, insan genomunun yaklaşık olarak 19.567 gene sahip olduğu anlaşılmış ve bunların büyük çoğunluğunun özelliği belirlenmiştir. Günümüzde klinikte konulan hastalık tanıları, moleküler genetik incelemeler ile desteklenmektedir.
i. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR)
Hücre içinde kendiliğinden meydana gelen DNA replikasyonunun tüp içinde taklit edilmesiyle istenilen bölgenin çok fazla sayıda çoğaltılmasını sağlayan bir yöntemdir. Onkogenezisin araştırılması, kalıtsal hastalıklarda taşıyıcı ve hastada mutasyonların taranması, prenatal tanı, klinik örneklerde patojen organizmaların saptanması, adli tıpta DNA ve parmak izi araştırması, prob oluşturulması, klonlama, gen ekspresyon araştırmalarında, DNA dizi analizinde büyük miktarda DNA örnekleri oluşturulmasında, in vitro fertilizasyon yapılan tek hücrede, implantasyon öncesi genetik testlerin yapılmasında kullanılır (31).
ii. Alel özgü oligonükleotid (ASO)
Hastalığa sebep olan mutasyon biliniyorsa, hastadan alınan DNA örneğinde bu mutasyonun bulunup bulunmadığı tespit edilir. Biri normal gene özgü, diğeri bilinen bir genetik mutasyona özgü olan sentetik oligonükleotidler prob olarak kullanılır, analiz edilen örnekte bulunabilecek tek bir baz çifti uyuşmazlığı bile duyarlı olarak saptanabilir. Yalnızca sınırlı ve az sayıdaki, farklı mutasyonlar ile karakterize genetik hastalıklar için uygundur (6).
iii. Mikroarray tekniği
Tek bir array üzerinde tüm genomu inceleme yöntemidir. Moleküler biyolojik ve robotik tekniklerin bir arada kullanımı sonucunda, cam matriks üzerinde herbiri spesifik bir geni temsil eden binlerce DNA parçasının yapıştırılması ile elde edilen arrayler ile hücrelerde, gen ekspresyon analizleri ve tek nüklotid polimorfizmlerinin genotiplemelerini yapmak mümkündür. Kullanım alanları; kanser araştırmaları, gen ekspresyon çalışmaları, normal ve patolojik durumlarda gen ekspresyon farklarının incelenmesi, mutasyon ve polimorfizm tespiti, ilaç hedeflerinin tanımlanması, gen haritalanması, DNA dizi analizi, çevresel araştırmalar, hastalık alt tiplerinin araştırılması, epigenetik modifikasyonlara yönelik çalışmalardır.
DNA mikroarray’i cam, plastik veya silikon gibi katı bir yüzeye tutturulup sabitlenen, sıralı şekilde (array) oluşturulmuş, mikroskobik DNA spotlarıdır. Yüzeye tutturulan DNA parçaları prob olarak adlandırılır ve genellikle 20 ila 100 nükleotid uzunluğundadır. Katı yüzeye spesifikliği bilinen DNA veya proteinin sabitlenmesi ile çipler oluşturulur. DNA’yı tutan bu katı yüzey slayt olarak adlandırılır.
Çiplerin hazırlanması iki yöntem ile yapılabilir, birincisi çip üzerinde fotolitografik olarak oligonükleotid sentezidir, bu yöntemle DNA ya da gen parçaları direk cam maddenin üzerinde sentez edilir. İkinci yöntem komplementer DNA’nın direkt olarak yüzeye bırakılmasıdır, bu teknikte genomik DNA parçaları cam yüzeydeki yerlerine çok uçlu mekanik yazıcılar ya da ink-jet yazıcılar aracılığı ile spotlanır. Çiplerin DNA fragmentleri, genlerin PCR amplifikasyonu ile elde edilip, cam film üzerine robotic spotting yöntemi ile yerleştirilir.
Örneklerin hazırlanmasında örnekten elde edilen hedef mRNA’lar, reverse transkriptaz yardımı ile cDNA’ya çevirilir. Elde edilen cDNA’lar floresan belirteçler ile işaretlenmelidir. İşaretleme için siyanin boyaları en sık kullanılanlardır. Amplifikasyonu yapılan örnekler, işaretçi boyalar ile doğrudan birleştirilir.
Etiketlenmiş cDNA’lardan oluşan oluşum, hibridizasyon için mikroarray üzerine inkübe edilir. Örneğimiz içerisinde, mikroarray probları ile komplementer diziler bulunduğunda hibridizasyon gerçekleşir. Hibridizasyon miktarı, ilgili gen için bulunan mRNA miktarına
Yıkama; reaksiyonun doğru değerlendirilmesi için, prob ile bağlanmamış dizinlerin, non- spesifik sinyal odaklarının uzaklaştırılması işlemidir. Daha sonra etiketlerin uyarılması aşamasına geçilir. Bu aşamada amaç, mikroarrayde hibridize olan dizinlerin görülüp değerlendirilmesini sağlamaktır. Verileri işleme ve yorumlama aşamasında, spotlardaki floresan ışık yoğunluğunu ölçen, floresan sinyal dedektörleri kullanılır. Dedektörlerden gelen veriler bilgisayarlarda özel yazılım programları ile analiz edilir.
Az miktarda DNA örneği ile, metafaz plağı gerekli olmadan, DNA üzerindeki tek baz değişikliklerinin de tespitini ve birden fazla genomun karşılaştırılabilmesini sağlayan bir yöntemdir (32).
Oligonükleotid Mikroarray’de problar sekansı bilinen ya da tahmin edilen mRNA’lara uygun olacak şekilde dizayn edilirler. Bu mikroarrayler gen ifadesinin kesin değeri ile ilgili tahminler verir. Array’deki her bir geni temsil etmek üzere genellikle 25-70 nükleotid uzunluğunda oligonükleotidler kullanılır. Daha küçük boyutlarda prob bağlama etkinliği de daha düşük olmaktadır, küçük oligonükleotidlerin özgüllüğü daha fazladır.
Spotlu Mikroarray’lerde problar oligonükleotid, cDNA veya mRNA’lara karşılık gelen PCR ürünlerinin küçük parçalarıdır. Bu tip array’lerde genellikle 2 farklı boya ile işaretlenmiş, karşılaştırılacak 2 örnekten (hasta ve kontrol) gelen cDNA ile hibridize edilmiştir. Örnekler karıştırılıp tek bir mikroarraye hibridize edilebilir. Lazer ile taranması sonucunda kayıplar ve kazançlar görülebilir. Dezavantajı gen ifadesi düzeyini kesin olarak gösterememektedir.
Genotip Mikroarray’ler içerisinde DNA mikroarrayleri belli bir pozisyondaki genom dizisini okumada kullanılır. SNP Mikroarray’ler bireylerde ve popülasyonda genetik varyasyonu belirlemek için kullanılan özel bir DNA arraydir. Ayrıca kansere neden olan somatik mutasyonların, heterozigosite kaybının belirlenmesinde kullanılır (33).
iv. DNA dizi analizi
En yaygın kullanılan yöntem Sanger dizi analizidir. Hem normal hem mutant genlerin analizi için kullanılabilir. Bir zincir sonlandırma tekniği olan Sanger dizi analizi; DNA polimerazı inhibe etmek için nükleotidlerin kimyasal analoglarını kullanır. Sentezlenmekte olan DNA zincirine bağlanan bu analoglar, deoksinükleotidtrifosfatların fosfodiester bağı oluşturmasını engelleyerek DNA zincirinin daha fazla uzamasına engel olur. Spesifik sonlanmalar oluştuktan sonra enzimatik reaksiyon ile ürünler kapiller elektroforezde yürütülerek analiz edilir (34). Yeni nesil dizi analizi (NGS), tüm genom, transkriptom veya daha küçük hedef bölgelerdeki milyonlarca DNA parçasının dizilenebilmesini sağlar. Dizilenecek olan DNA önce parçalara ayrılır. Daha sonra bu parçalanan uçlara adaptör dizileri ve barkod dizileri eklenir. Adaptör dizileri ile yüzeye tutunmuş olan tek zincir DNA parçalarına, işaretli bazlar eklenerek diğer zincirin sentezi gerçekleştirilir. Her yeni bazın eklenmesi ile ortaya çıkan ışık, pH veya iyon dengesinin değişimi sayesinde, kimyasal ve foto sensörler hangi bazın eklendiğini kaydedebilir. Reaksiyon tamamlandığında bilgisayarda kompleks biyoinformatik analizler yapılır. Bu çalışma hem mutasyon analizlerini hem de kromozom sayısındaki artma-azalmaları tespit edebilir. Kalıtsal kanser sendromlarında mutasyonun tespiti, kanser somatik mutasyon analizi, farmakogenetik, mikrobiyolojik çeşitliliğin ortaya konması, nadir hastalıklara neden olan mutasyonların ortaya konması, fenotipik-genotipik heterojenite gösteren hastalıkların tanısının konması, çevre-tarım zararlılarının konak seçimi, atasal DNA ile çevresel kontaminasyonun ayırt edilmesi gibi bir çok konu NGS’nin çalışma alanlarındandır, maliyet açısından avantajlı bir yöntemdir (35).