Quantidades limitadas de amostra requerem métodos de amplificação para obtenção de RNA suficiente para experimentos de hibridação. De forma geral, duas estratégias têm sido utilizadas para obter a quantidade suficiente de RNA para hibridação em membrana de cDNA. Os métodos baseados em PCR, embora eficientes para gerar cDNAs amplificados em abundância, têm a propensão de distorcer os dados de expressão devido à amplificação preferencial de transcritos específicos. A outra estratégia envolve a amplificação linear do aRNA pela transcrição in vitro com RNA polimerase T7, que permite uma maior retenção das freqüências relativas dos transcritos. Este método linear proporciona uma maior variedade de tamanhos distintos de transcritos e média maior dos tamanhos dos fragmentos, mas ambos os métodos introduzem alguns desvios quando comparados ao RNA não amplificado (GINSBERG, 2005; JENSON et al., 2003; WADENBÄCK et al., 2005; WANG E et al., 2000). Robert e colaboradores (2002) mostraram que há manutenção do perfil de regulação gênica com a amplificação linear do RNA, contudo, a taxa de amplificação para cada gene depende da representatividade do transcrito deste gene na
amostra. Ou seja, aqueles transcritos mais presentes ficam mais evidenciados, dificultando a detecção dos genes menos expressos após a amplificação do RNA.
Foram realizadas um total de seis extrações de mRNA, a saber, três extrações de diferentes pools contendo 50 embriões cada dos grupos R8 e L8, seguidas de amplificação do aRNA, com uso do MessageAmp aRNA Kit (Ambion), que é baseado no protocolo de amplificação linear descrito por Van Gelder e colaboradores, em 1990. A amplificação do aRNA é obtida com a utilização do iniciador Oligo (dT) com promotor para enzima T7 para a síntese do cDNA e uso da enzima RNA polimerase T7 na transcrição in vitro.
A quantidade média de mRNA em cada embrião 8 células em camundongo é aproximadamente 0,44 pg (PIKÓ; CLEGG, 1982); portanto, em um grupo de 50 embriões para cada extração, estima-se a presença de 22pg de mRNA. Após a amplificação em duas etapas, a taxa de amplificação média foi de cerca de 400 mil vezes. Estudos na última década que analisaram a taxa de multiplicação do aRNA mostraram resultados extremamente variáveis, dependendo da concentração inicial das amostras e do uso de protocolos modificados. Na descrição do método, foi obtido apenas 3 a 5 vezes de multiplicação em uma única etapa, mas com modificações, esta taxa passou para 15 vezes a até 2.500 vezes em uma única etapa (BAUGH et al., 2001; DONNISON; PFEFFER, 2004; EBERWINE, 1996; GINSBERG et al., 2005; GOMES et al., 2003; JENSON et al., 2003; MOLL; DUSCHL; RICHTER, 2004; PHILLIPPS; EBERWINE, 1996; SCHNEIDER et al., 2004; VAN GELDER et al., 1990; WANG E. et al., 2000; WANG, 2005; ZHU; XU; BABA, 2006). Utilizando o MessageAmp Kit (Ambion), Chen e colaboradores (2005) e Kato e colaboradores (2007) obtiveram uma taxa de 1.000 vezes de multiplicação em uma única etapa. Após a segunda etapa de amplificação, autores relataram taxas também com grande variação na multiplicação geral, sendo relatado valores de 190 vezes a 120.000 vezes, com grande parte dos dados entre 2.500 e 7.000 vezes de amplificação geral, havendo grande fidelidade de uso de aRNA em experimentos de hibridação (BAUGH et al., 2001; GOMES et al., 2003; JENSON et al., 2003; LI et al., 2004; PARK et al., 2004; PATEL et al., 2005; STOYANOVA et al., 2004; WANG E. et al., 2000; WANG, 2005; ZHU; XU; BABA, 2006). Em um laboratório de produção de embriões in vitro de rotina, considerando a disponibilidade de 1.000 oócitos por semana, seriam produzidos cerca de 400 embriões do grupo R8 e 200 embriões do grupo L8. Avaliando a quantidade de RNA obtida após as duas etapas de amplificação, é possível observar que seriam necessários aproximadamente 800 anos de produção in vitro de embriões para obtenção de tal quantidade equivalente, caso não fosse utilizada a metodologia de amplificação do aRNA. Assim, esta metodologia permite obter RNA suficiente para experimentos de hibridação a partir de quantidades limitadas de amostras biológicas (GINSBERG, 2005; JENSON et al., 2003; STOYANOVA et al., 2004),
todavia predispõe a introdução de desvios em relação ao padrão inicial de transcrição (WADENBÄCK et al., 2005).
Apesar da grande quantidade de aRNA, a terceira etapa de amplificação do aRNA mostrou-se necessária para a obtenção de concentração suficiente de RNA, especialmente para o grupo de embriões lento, a fim de realização da hibridação em macro arranjos. Assim, para não introduzir diferenças entre os grupos, foi feita a terceira etapa de amplificação do aRNA para ambos os grupos. Entretanto, para que fossem normalizadas as concentrações de RNA iniciais no arranjo, foram separados 15 μg de aRNA de cada grupo embrionário (R8 e L8) para confecção da sonda. Esta concentração foi equivalente a 50 embriões do grupo R8 e 130 embriões do grupo L8.
6.3 Hibridação das membranas (macroarrays)
As técnicas de macro e micro arranjo de DNA constituem poderosas ferramentas para monitorar simultaneamente o perfil de expressão de muitos genes, permitindo a análise em larga escala dos fenômenos biológicos que ocorrem em células, tecidos ou organismos. Estas técnicas têm sido empregadas em muitos estudos na embriologia (ADJAYE et al., 2007; ARONOW; RICHARDSON; HANDWERGER, 2001; CHEN et al., 2005; DALBIÈS-TRAN; MERMILLOD, 2003; ELLESTAD et al., 2006; FAIR et al., 2007; JEONG et al., 2006; JONES et al., 2008; KATO et al., 2007; LI; CUI; KIM, 2006; MAMO et al., 2006a, 2006b; SIRARD et al., 2005) proporcionando a descoberta de inúmeros genes importantes em cada etapa, para cada organismo.
Neste estudo, para cada grupo experimental (R8 e L8) foram utilizadas três membranas apresentando 936 pontos em duplicata, sendo 156 controles de qualidade de espotagem e hibridação distribuídos na membrana e 780 clones provenientes da biblioteca humana de cDNAs oriunda de vários tecidos, obtida do Consórcio IMAGE. As membranas foram denominadas SH (Seleção Humana) e numeradas.
Todas as membranas, por apresentarem genes representados em duplicata, foram analisadas como duas repetições cada uma. Apenas uma membrana do grupo de embriões R8 não pôde ser avaliada pela grande quantidade de background e foi desconsiderada da análise nas etapas seguintes. Assim, o grupo L8 apresentou seis repetições (oriundas de três membranas) e o grupo R8 apenas quatro repetições (oriundas apenas de duas membranas pela impossibilidade de análise da terceira membrana). Mesmo nas membranas
que participaram da análise, algumas porções e pontos de cada membrana foram excluídos em análise visual no Array Gauge v1.1 (Fuji Photo Film, Tokyo, Japan) devido ao
background intenso.
Após a captação das imagens e quantificação dos sinais obtidos nos pontos, foi feita a subtração do valor de background não específico, presente em toda a membrana, de acordo com as instruções do fabricante do programa. Esta subtração busca remover o nível de ruído, permitindo fazer uma comparação entre os sinais específicos de cada ponto (CAUSTON; QUACKENBUSH; BRAZMA, 2003).