Fizyolojik Analizler

Doğal maddelerin muamelesiyle bitkilerde meydana gelebilecek morfolojik gelişim farklılıklarının temelinde yatan fizyolojik aktivite değerlerinin ortaya konabilmesi amacı ile fizyolojik analizler yapılmıştır. Deneme alanlarında, bitkilerde yaşamsal öneme sahip azot, protein ve nükleik asit (RNA ve DNA) ile fotosentezde önemli role sahip klorofil (Kl a, Kl b, Kl a+b) ve karotenoit ve amarantin miktarları tespit edilmiştir.

Fotosentez bitkilerin ve bazı bakterilerin güneş enerjisini kullanarak organik bileşikleri sentezlemesi olayıdır. Yüksek yapılı bitkilerde fotosentez faaliyetinin en çok olduğu yer yapraklardaki mesofil dokudur. Bu dokuda çok sayıda kloroplast bulunur ve bunlar özelleşmiş ışık absorbe eden yeşil renkli pigment olan klorofil içerir. Fotosentezde bitki ışık enerjisini kullanarak suyu oksitler ve açığaçıkar. Eş zamanlı olarak organik maddelere indirger (Akman ve Güney 2005).

Bugün birbirinden kolaylıkla ayırt edilebilen 8 farklı klorofil tipi bilinmektedir. Bunlar;

klorofil a, b, c, d, e, bakterioklorofil a, bakterioklorofil b ve chlorobium (bacterioviridin)’dir.

Bunlardan klorofil a ve klorofil b en çok bilinen ve yüksek bitkilerde, yeşil alglerde en bol olarak bulunanlardır. Klorofil elementi genel olarak C, H, O, N ve Mg elementlerinden oluşur. Klorofil a (C55H72O5N4Mg), klorofil b (C55H70O6N4Mg) kapalı formülleriyle gösterilirler. Karotenoitler, klorofil pigmentleri gibi kloroplastlarda, özellikle granada yerleşmişlerdir. En iyi bilinen karotenoit pigmentleri turuncu-sarı renkli olan karotenlerdir.

Karoten, bir doymamış hidrokarbon olup kapalı formülü C40H56’dır. Karotenoitler fotosentezde iki yönden önemli role sahiptirler. İlk olarak karotenoitler ışık ve oksijen karşısında klorofillerin parçalanmasını önlerler. Karotenoitlerin fotosentez için ikinci önemi, ışık absorbsiyonunda üstlendikleri görevle ilgilidir. (Bozcuk 1986, Atik’den 2008).

Amaranthus türlerinde bulunan ve en büyük karoten grubu olan amaranthin (C29H31O19N2) de hem fotosentezdeki rolü hem de renk pigmenti olması açısından önemlidir (Gins vd. 2002).

Azot, geniş ölçüde proteinlerin yapısına girmesi sebebiyle bitkiler için oldukça önemli bir elementtir. Aynı zamanda bitki bünyesindeki karbonlu bileşiklerle birleşerek farklı molekülleri oluşturur, çeşitli solunum enzimlerinde koenzim olarak vazife gören bazı vitaminlerin ve ayrıca nükleik asitlerin bileşimine girer. Bitki kuru maddesinde bulunan azot miktarı, bitkinin türüne, yaşına, topraktaki azot miktarına göre değişmektedir. Azot, bitkideki birçok organik bileşiğin yapısında bulunur. Yapılan araştırmalar, bitkilerde protein sentezinin hücrenin bazı fizyolojik faaliyetleri ile de yakından ilgisi olduğunu göstermektedir. Bitkilerde solunum hızı, hücre bölünmesi ve tuz akümülasyonu gibi olayların protein sentezi ile yakından ilgili olduğu bilinmektedir (Bozcuk 1986, Atik’den 2008).

Nükleik asitler, bitki ve hayvan hücrelerinde bulunan önemli moleküllerdir. Her canlı organizmada nükleik asit bulunur ve bunlar canlıların temel yaşam olayını yönetir. Kontrol eder ve bir dölden diğerine devamlılığını sağlar. Nükleik asit ilk kez çekirdekte görüldüğü için bunlara çekirdek asitleri adı verilmiştir. Bir bireyin veya hücrenin genetik bilgilerinin tümü DNA (deoksiribonükleik asit)’da bulunur. Bu repikasyon sırasında hataları düzeltme kapasitesini sağlar. RNA ise bilgilerin aktarımında ve protein sentezinde görev alır (Akman ve Güney 2005).

Analizler, 2006 ve 2007 yıllarında 15 temmuz, 15 ağustos ve 15 eylülde olmak üzere 3 kez tekrarlanmıştır. Analizlerde kullanılan bitkiler, işlemlere ait tekrardan da o tekrarı temsil

etmek üzere birer fidenin rastlantısal olarak seçilmesiyle elde edilmiştir. Fizyolojik analizler ile fidelere ait azot, protein, klorofil (Kl a, Kl b, Kl a+b), karotenoit ve nükleik asit (RNA ve DNA) miktarları tespit edilmiştir. Ancak bu analizler teknik ve fiziki yetersizlikler nedeniyle Rusya Tarım Bilimleri Akademisi Agrokimya Araştırma Enstitüsü’nde yaptırılmıştır.

Azot ve protein miktarları kuru ağırlığın yüzdesi cinsinden, klorofil (Kl a, Kl b, Kl a+b) ve karotenoit miktarları kuru maddede mg/g cinsinden, nükleik asit (RNA ve DNA) miktarları ise yaş maddede mg/g cinsinden hesaplanmıştır.

a) Klorofil Miktarının Tayini: Bitki yapraklarındaki klorofil miktarı fotoelektrokolorimetre (FEK-M) metodu ile tayin edilmiştir (Dmitriyeva ve Kefeli 1991). Bu metot ile çözeltinin rengi değil, onun optik sıklığı (yoğunluğu) fotoelementle ve galvanometre ile tayin edilir.

Renkli çözeltilerin konsantrasyonunu tespit etmek için fotoelektrokolorimetrede yer alan iki fotoelementteki elektrik akımının güçleri arasındaki fark ölçülür. Fotoelement, ışık enerjisini elektrik enerjisine dönüştüren bir alettir. Çözeltiden geçen ışık demetinin yoğunluğunun değişimini karakterize etmek için genellikle ışığın kapasitesinden (T) veya optik sıklığından (yoğunluk) istifade edilir. Fotoelektrokolorimetre 4 ışık filtresi ile donatılmıştır. Bunlar:

renksiz, yeşil, mavi ve kırmızıdır. Işık filtresini seçerken çözeltinin rengi dikkate alınmalıdır.

Analiz için önce FEK-M elektrik prizine takılır ve galvanometre “açıktır” konumuna getirilir.

Sonra ışık karşısında olan bağlayıcı kol açılır ve ışığın geçiş yoluna kırmızı filtre koyulur. 15-20 dakika geçtikten sonra ölçümlere başlamak mümkündür. Bunun için uzunluğu 10 mm olan iki hendeğe etil alkol, üçüncüye ise klorofil içeren çözelti dökülür. Hendekler kapakla kapatılır. Soldaki hendeğe etil alkol içeren balonu, sağdakine ise çözelti (klorofilli) ve etil alkol balonları yerleştirilir. Bundan sonra galvanometre “0” konumuna getirilir ve sağdaki ışık demetinin geçtiği yola etil alkol içeren balon koyulur. Galvanometrenin hassasiyeti önce düşük olan “1” konumuna, sonra ise yüksek “2” konumuna getirmek gerekir. Galvanometreyi açarak sol sapına bağlı olan çözeltinin optik sıklığı ölçülür. Ölçümler en az 3 defa yapılmalıdır. Alınan sonuçlar kaydedilir. Sol sapın verilerini kalibre eğrisine esasen konsantrasyon parametrelerine çevirmek gerekir. Bunun için klorofilin gittikçe artan konsantrasyonlarından ibaret olan standartlar hazırlanır ve onların her birisi için optik sıklığın ölçümleri tayin edilir. Standart olarak Hetri Çözeltisinden de istifade edilebilir.

Klorofil konsantrasyonunu hesaplamak için ordinat okunda optik sıklığın göstergesini bulmak gerekir ve bu göstergenin kalibre eğrisi ile kesişme noktasında horizontal (yatay) çizgi çekilir.

Kesişme noktasından apsis okuna dikme indirilir ve klorofilin miktarı tayin edilir.

b) Toplam Azot Miktarının Tayini ve Proteinin Hesaplanması: Bitki materyalinde toplam azot miktarının tayini ve proteinin hesaplanması Kjeldahl Metodu (Bremner 1965) ile yapılmıştır. Bitki materyalinde proteinlerin ve diğer azot içeren maddelerin nicel analizleri, bu bileşenlerde bulunan azotun tayini ile yapılmaktadır. Kjeldahl Metodunun prensibi tüm ülkelerde standart olarak kabul edilmiştir.

Analizler kuru bitki materyalinde yapılmaktadır. Bunun için bitki materyali (yaprak) vantilatörlü kurutma fırınında önce 20-30 dakika 105 °C’de, sonra ise 8-10 saat 60-70 °C’de kurutulur. Kurutma esnasında materyalde bulunan su buharlaşır ve enzimlerle mikroorganizmaların faaliyetleri durdurulur. 5 g yaprak analitik terazide tartılır ve Kjeldahl balonuna (250 ml) yerleştirilir. Bu balonun içine aşağıdaki kimyasallar dökülür: 20 ml katı H2SO4 (özgül ağırlığı 1,84) ve katalizör (2 damla civa ve 8 g K2SO4 veya %60 su içermeyen Na2SO4 ve % 40 K2SO4 karışımı). Daha sonra Kjeldahl balonu içindeki materyaller zayıf ateşte (gaz veya elektrik sobası) yakılmaya bırakılır. Balona, oluşan köpüğü azaltmak için 1 ml etilalkol dökülür. Ara sıra köpüğün balonun dibine batması için balonu ateşten almak gerekir ve köpük azaldığında balon yeniden ateşin üzerine koyulur.

Azot tayininde suyun buharlaşması için önce Kjeldahl balonundaki materyal önce hafif sonra ise yüksek ateşle yakılır. İlk aşamada işlemler çözeltinin rengi açık olana kadar yapılır ve sonra tam minerilizasyonun gerçekleşmesi için 30 dakika yeniden yakılır.

Yakma olayı bittiğinde Kjeldahl balonları gaz ocağından alınır ve dibinde asbest olan ahşap yuvalı kutulara yerleştirilerek dolabın içine koyulur. Tam soğutulmamış balonlara üçte bir hacmine kadar saf su dökülür. Suyu yavaş yavaş damla halinde dökmek gerekir. Soğutucunun borusunun altına alıcı balon yerleştirilir ve amonyağı yakalama amacı ile bu balonun içine 25 ml 0,1 N H2SO4 ve birkaç indikatör damlası dökülür. Bundan başka alıcıların içine 15-25 ml saf su dökülür. Soğutucunun borusu alıcı balondaki asidin içine indirilir ki bu da amonyağın kaybolmasını engeller. Bundan sonra ana çözelti hacmi 500-750 ml olan Kjeldahl balonuna dökülür. Çözeltinin alkalik olması için 10 ml %30 kostik soda eklenir. Eğer lakmus kağıdı mavi renk alır ise demek ki ortam alkalidir. Sonra balon Kjeldahl kapağı ile kapatılır, soğutma

ile birleştirilerek kovma donatımına yerleştirilir ve ocak yakılır. Amonyağın kovulması 2/3 sıvının kovulmasına kadar yapılmalıdır. 15-20 dakika geçtikten sonra amonyağın %70-90’ı kovulur. Soğutucunun borusu alıcı balondan (asidin içinden) ayrılır. Alıcı balonun içine 4-5 damla indikatör dökülür ve H2SO4 (sülfürik asit) artık kalan kısmı 0,1 N (normal) NaOH ile titre edilir. Titre esnasında reaksiyon asitten alkaliye değişerek, indikatörün rengi değişir:

kongort mavi renkten kırmızıya, melitrot ve metilenblau ise kırmızı-mor renkten zümrüt yeşil renk kazanır.

Titre olunmuş H2SO4’in hacmi mililitre titre olunmuş NaOH çözeltisi gibi gösterilmelidir.

Bunun için alıcı balona 20-50 ml 0,1 N H2SO4 dökülür ve 0,1 N NaOH ile titre edilerek asitle alkali arasındaki oran tespit edilir. Sonra alkalinin (0,1 N NaOH) titresi mg azot olarak kabul edilir ve hesaplanır. Elde edilen azotun miktarı 6,25 katsayısı ile çarpılarak protein miktarı hesap edilmiş olur.

c) Nükleik Asit Tayini: Nükleik asitlerin tayini için Turkova (1965) metodu kullanılmıştır.

Bu yöntemde genç yapraklardan (250 mg) nükleik asitleri ayırmak için önce kuvars, kum veya şişe tozu ile yapraklar havanda ezilir ve sıcak (70 °C) etil alkolle renksizleştirilir. Daha sonra saf su ve 0,2 normal HClO4 asidi ile 3-4 kez yıkanarak üzerine etil alkol ve kükürt eteri 1:1 oranında dökülür. 24 saat 20-21 °C oda ısısında kurutulur. RNA asitlerini ayırmak için havana 1 normal HClO4 dökülür ve soğutucu dolapta 3 gün bekletilir. DNA’yı ayırmak için 0,5 normal HClO4 ilave edilir ve su banyosunda 68-70 °C’de muamele edilir. RNA’nın hacmi 50 mililitreye, DNA’nın ise 25 mililitreye çıkartılır. Numune soğutulduktan sonra ölçümler RNA için 290 nm, DNA için ise 270 ve 290 nm arasında spektrofotometrede tayin edilir.