Fatih Sultan Mehmet

Os principais nutrientes necessários para o crescimento, manutenção e biossíntese de produtos de interesse por microrganismos aeróbios são carbono, nitrogênio, fósforo, enxofre e oxigênio correspondendo entre 80 e 90% do material celular (Moo-Young, 1985).

Uma peculiaridade do Streptomyces clavuligerus é a sua incapacidade de assimilar glicose. Tal fato é devido à incapacidade deste microrganismo de transportá-la através de sua membrana (Zhang e Demain, 1992 apud Garcia-Dominguez et al., 1998). Para contornar este problema, existem vários trabalhos em literatura utilizando outras fontes de carbono e energia como glicerol, óleos e amido.

Pruess e Kellett (1983) descreveram que o glicerol, a maltose e a dextrina são ótimas fontes de carbono para a síntese de antibióticos em culturas de Streptomyces

clavuligerus NRRL 3585 (ATCC 27064).

Romero et al. (1984) descreveram que a utilização do glicerol como fonte de carbono promove a formação de ácido clavulânico. Também foi avaliada a utilização de sacarose como fonte de carbono, substrato que não foi utilizado durante os cultivos.

Lee e Ho (1996) estudaram a utilização de várias fontes de carbono na produção de ácido clavulânico por Streptomyces clavuligerus NRRL 3585 (ATCC

27064). Em seus trabalhos a maior produtividade de ácido clavulânico é encontrado quando se utilizou óleo de dendê como fonte de carbono e energia. Os autores atribuem a esse resultado o fato de que um dos produtos finais obtidos pela ação da lipase, enzima responsável pela quebra da molécula de óleo em ácidos graxos e glicerol, sendo o último considerado precursor na formação do ácido clavulânico.

Rius et al. (1997) estudaram a influência da natureza da fonte de carbono e a concentração de substrato na produção de cefalosporina C por Streptomyces

clavuligerus NRRL 3585 (ATCC 27064). Foram utilizados glicerol e amido como

fontes de carbono em concentrações de 1, 2 e 3% (m/v) de substrato. Os autores concluíram que se obteve uma maior produção de cefalosporinas quando se utilizou a concentração menor de substrato.

Large et al. (1998), baseados em resultados prévios (Lee e Ho, 1996), utilizaram lipídeos e óleos como fontes de carbono para a produção de ácido clavulânico por Streptomyces clavuligerus (linhagem doada pela Glaxo-SmithKline). Os estudos relacionados à utilização dessas fontes de carbono são geralmente justificados por serem de baixo custo.

Também são encontrados em literatura vários trabalhos utilizando diferentes fontes de nitrogênio na composição do meio de cultura.

Estudos realizados por Romero et al. (1984) indicam que concentrações acima de 10 mM de sais de amônia e ácido glutâmico reduziram a biossíntese de ácido clavulânico por Streptomyces clavuligerus NRRL 3585 (ATCC 27064). Os autores propuseram o uso de aminoácidos em meios de cultura para suprir as necessidades de nitrogênio do microrganismo.

Estudos sobre a adição de ácido glutâmico, arginina e ornitina foram realizados por Romero et al. (1986), em que se relata a baixa produção de ácido

clavulânico na presença de ácido glutâmico, em contraste com uma melhor produção observada nas presenças de ornitina e arginina, em torno de 20 mg/l.

Spizek et al. (1995) ressaltam as vantagens da utilização de derivados de soja como constituintes do meio de cultura em processos fermentativos envolvendo actinomicetos.

Mayer e Deckwer (1996) descrevem a utilização de meio de cultura a base de farinha de soja. A farinha de soja é uma boa fonte de nitrogênio, o que pode explicar a alta produtividade de ácido clavulânico obtida nesse trabalho.

Jones et al. (1997) descrevem a não ocorrência de produtos oriundos de metabolismos secundários em cultivos de Streptomyces clavuligerus NRRL 3585 (ATCC 27064) quanto este é realizado sob condições de limitação de nitrogênio.

Romero et al. (1997) descrevem a utilização de NH4Cl como única fonte de

nitrogênio com ou sem a adição de arginina na produção de cefalosporinas. Os autores concluíram que a adição da arginina no meio de cultura diminui a produção de antibiótico por este microrganismo.

Gouveia et al. (1999) compararam diferentes fontes de nitrogênio na produção de ácido clavulânico por Streptomyces clavuligerus NRRL 3585 (ATCC 27064), sendo que os melhores resultados foram obtidos quando se utilizou Samprosoy 90NB, um hidrolisado protéico de soja. Foram utilizadas como fontes de nitrogênio, além do Samprosoy 90NB, farinha de soja e aminoácidos. A quantidade de nitrogênio total foi fixada para que a diferença entre os resultados fosse atribuída somente ao tipo da fonte de nitrogênio utilizada.

Gouveia et al. (2001) compararam meios de cultura contendo diversas fontes de nitrogênio combinadas (água de maceração de milho, extrato de levedura e peptona) ou não com o extrato protéico de soja (Samprosoy 90NB) para a produção de ácido

clavulânico por S. clavuligerusi NRRL 3585 (ATCC 27064). Cabe ressaltar que os autores tiveram o cuidado de adicionar a mesma quantidade de nitrogênio nos meios de cultivo. Com isso, concluiu-se que o meio de cultivo contendo somente extrato protéico de soja apresentou o melhor resultado.

O fosfato é um nutriente muito importante nas formações de moléculas importantes para as células tais como DNA, RNA, fosfolipídeos, ATP entre outras utilizações. Geralmente a sua fonte principal são os fosfatos inorgânicos, mas os microrganismos podem também metabolizar alguns compostos orgânicos que contêm fosfato (Moo-Young, 1985).

Romero et al. (1984) estudaram a influência exercida pela concentração de fosfato no meio de cultura. Os autores concluíram que para concentrações acima de 10 mM, a produção de ácido clavulânico começa a ser inibida.

Lebrihi et al. (1987) descrevem a influência do fosfato nas produções de ácido clavulânico e de cefamicina C por Streptomyces clavuligerus NRRL 3585 (ATCC 27064). Os autores observaram a repressão pelo fosfato, dos sistemas enzimáticos de biossíntese de ácido clavulânico e cefamicina C.

O enxofre se torna necessário por fazer parte de aminoácidos como a cisteína e a metionina e também na síntese de vitaminas como a biotina e a tiamina. Ele pode ser obtido de fontes inorgânicas como sulfatos e de fontes orgânicas como alguns aminoácidos (Moo-Young, 1985).

Romero et al. (1984) observaram que durante cultivos com Streptomyces

clavuligerus NRRL 3585 (ATCC 27064), houve a formação de ácido clavulânico na

ausência de sulfato. Foi demonstrado, que mesmo não havendo átomos de enxofre na molécula do ácido clavulânico, houve aumento na formação do inibidor de β-lactamase quando se utilizaram concentrações acima de 4 mM de sulfato.

Também há em literatura a otimização de meio de cultivo para a produção de ácido clavulânico tal como os trabalhos realizados por Gouveia et al. (2001) e por Wang

et al. (2004).

Gouveia et al. (2001) otimizaram o meio de cultivo para a produção de ácido clavulânico por S. clavuligerus NRRL 3585 (ATCC 27064). O meio de cultivo era composto por glicerol, K2HPO4 e Samprosoy 90 NB. Neste trabalho os autores

concluíram que a melhor concentração de glicerol e de K2HPO4 a serem utilizadas são

de 20 e 1,58 g.L-1, respectivamente. Quanto à concentração de Samprosoy 90 NB, os autores concluíram que quanto maior a concentração da fonte de nitrogênio maior será a produção de ácido clavulânico por Streptomyces clavuligerus.

No trabalho realizado por Wang et al. (2004), os autores utilizaram métodos estatísticos para determinar a melhor composição do meio de cultura para a produção do inibidor de β-lactamase por S. clavuligerusATCC 27064. O meio de cultivo utilizado era composto por glicerol (de 15 a 18,75 g.L-1), farinha de soja (de 42 a 52,5 g.L-1), K2HPO4 (de 0,1 a 0,125 g.L-1) , MgSO4.7H2O (de 0,2 a 0,25 g.L-1) , FeSO4.7H2O (de

0,3 a 0,375 g.L-1) e ornitina (de 1,32 a 1,65 g.L-1). Com isso os autores concluíram que, dentro da faixa estudada, as concentrações de glicerol, KH2PO4 e de MgSO4 não

influênciam na produção de ácido clavulânico. Os autores também observaram que as concentrações de farinha de soja, de FeSO4.7H2O e ornitina influênciaram

significativamente a produção de ácido clavulânico e os seus valores otimizados foram 38,10 g.L-1; 0,395 g.L-1 e 1,177 g.L-1 respectivamente.