Etkin Mikrobiyal Türlerin Tespiti

KompostlaĢtırma esnasında, organik maddeyi substrat olarak kullanan mikroorganizmalar kompostlaĢtırma prosesinin performansını ve geliĢimini yansıtmaktadırlar. Organizmaların kompostlaĢtırma esnasında substratı metabolik yollarla nihai ürünlere dönüĢtürmesi ile fiziksel ve kimyasal parametrelerde önemli değiĢiklikler olmakta, buna bağlı olarak kompostlaĢtırma prosesinde rol alan mikrobiyal türlerde de değiĢimler meydana gelmektedir.

KompostlaĢtırma prosesinde mikrobiyal türlerin belirlenmesi, geçmiĢ yıllarda bakteri ve mantarların izolasyonu, tanımlanması veya sayım iĢlemleri ile gerçekleĢtirilmekteydi. Son yıllarda, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ve 16S rDNA temelli moleküler tekniklerle kompostlaĢtırma prosesinde mikrobiyal türlerin tayini ile ilgili çalıĢmalar gerçekleĢtirilmektedir (Ishii et al., 2000).

16S rDNA ve PCR temelli teknikler kompostlaĢtırma prosesinde klasik tekniklerle tespit edilemeyen türlerin çeĢitliliğini belirlemede ön plana çıkmaktadır (Dees and Ghiorse, 2001). Son yıllarda, profilleme teknikleri ile kombine edilen 16S rDNA temelli yaklaĢımlara olan ilgi giderek artmaktadır. KompostlaĢtırma prosesindeki tür tayininde, Denature Gradyan Jel Elektroforez tekniği (DGGE) profilleme tekniği olarak son yıllarda en çok kullanılan metotlardandır (Ishii et al., 2000; Ishii and Takii, 2003).

Mikroorganizmalar, çoğunlukla hücre yapısı ve fonksiyonlarına göre sınıflandırılmaktadır. Prokaryotik grup veya bakteriler, katı atıkların organik kısmının biyolojik olarak ayrıĢmasında önemlidir. Organik atıkların biyolojik olarak ayrıĢmasında görev yapan ökaryot organizmalar mantarlar ve aktinomisetlerdir. KompostlaĢtırma iĢlemi, nemli ortamda ve organik atıkları havalandırmak suretiyle kendiliğinden çoğalan mikroorganizmalar vasıtasıyla gerçekleĢtirilir. BaĢlangıçta çoğunlukla bakteri olan bu organizmaların çoğalması sırasında, ısı, CO2 ve su buharı açığa çıkar. Ġlk aĢamada, mezofilik bakterilerle birlikte aktinomisetler,

mantarlar ve mayalar; yağları, proteinleri ve karbonhidratları ayrıĢtırırlar. Sıcaklık 30 oC‟ye eriĢinceye kadar küf mantarları, bakteriler, protozoolar ve nematodlar kompostlaĢtırma iĢleminde etkin rol oynarlar. Sıcaklık 30-40 o_{C ye çıktığında aktinomisetler baskın hale}

gelmeye baĢlar ve topraksı bir koku oluĢtururlar. Aktinomisetler humuslaĢtırıcı organizmalar olarak da bilinmektedirler. Bunun yanında, bu türler antibiyotik etki üreterek patojenlerin ölmesini de sağlamaktadır. Sıcaklık 40-50 o_{C`ye çıktığında baĢlangıçtaki türler ölür ve 70}o

C ye kadar faaliyet gösterebilen termofilik bakteriler geliĢmeye baĢlar. Bu aĢamada geliĢen bakteri ve aktinomisetler, zor ayrıĢabilen organiklerin ayrıĢmasında görev yapmaktadırlar. Sıcaklık artıĢıyla birlikte patojen mikroorganizmalar da ölür. Ortamdaki besi maddesi tükendiğinde ısı düĢmeye baĢlar ve kompostun soğuması gerçekleĢir. Soğuyan komposta son özelliğini veren genellikle mantar ve aktinomisetlerden oluĢan türlerdir. Görüldüğü gibi sırası ile gerçeklesen kompost prosesinde tüm kademeler farklı mikrobiyal türler tarafından gerçekleĢtirilmektedir. Bu bakımdan kompostlaĢtırma prosesinin performansı ve geliĢimi mikrobiyal türlerle yakından iliĢkilidir (Demir ve Özkaya, 2009).

5.5.1 Mikrobiyal Tür Analizleri

Mikrobiyal tür tayini; nükleik asit ekstraksiyonu, PCR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu), DGGE (Denatüre gradyan Jel Elektroforezi) ve Nükleik Asit Dizisinin belirlenmesi kademelerinden oluĢmaktadır. Alınan numuneler, moleküler tekniklerde kullanılmak üzere hazır hale getirilmiĢtir. Numunelerden ilk olarak nükleik asitler ekstre edilmiĢ, ekstre edilen DNA‟lar, - 20°C‟de muhafaza edilmiĢtir. Ekstre edilen DNA karıĢımlarının 16S rRNA genleri, PCR yöntemi kullanılmak sureti ile ısı döngüleme (Thermal Cycler) aleti ile çoğaltılmıĢtır. Bu iĢlem sonrası metanojenik tür çeĢitliliği, “denaturing gradient gel electrophoresis” (DGGE) ve DNA dizi analiziyle tespit edilmiĢtir. Moleküler çalıĢmalarda PCR (Mycycler Thermal Cycler System), Elektroforez Cihazı, Jel Görüntüleme Sistemi (ORTE) ve Genetik Analiz Sistemi (Beckman Coulter CEQ 8000) kullanılmıĢtır.

5.5.2 Nükleik Asit Ekstraksiyonu

DNA izolasyonunda, numuneler 10 dakika 14000 devir/dakika‟da santrifüj edilerek konsantre hale getirildikten sonra zirconia/silica boncuklar kullanılarak mekanik olarak dağıtılmıĢtır. FASTPREP-24 cihazı ile gerçekleĢtirilen mekanik parçalamadan sonra ortaya çıkan DNA, FastDNA SPIN Kit (Q-BIOgene) prosedürüne uygun olarak saflaĢtırılmıĢtır.

5.5.3 Polimeraz Zincir Reaksiyonu

Klasik polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) amplifikasyonu ile çoğaltılan 16S rRNA genleri DGGE analizlerinde kullanılmıĢtır. 16S rRNA genleri için çeĢitli primerler kullanılarak Biorad Termocycler ile amplifikasyon gerçekleĢtirilmiĢtir.

5.5.4 Denaturing Gradient Gel Electrophoresis

Dizi analizi öncesi klonların tür farklılıkları, denatüre gradyan jel elektroforezi (DGGE) tekniği ile tespit edilmiĢtir. Farklı türler dizi analizi yöntemi ile doğrulanmıĢtır. DGGE, PCR ile çoğaltılmıĢ DNA örneklerindeki tek baz değiĢimlerinin ve polimorfizmin belirlenmesinde etkili bir genetik analiz yöntemidir. DGGE deneyinde denatüre madde (formamit ve üre karıĢımı), poliakrilamit jellerdeki yarı erimiĢ, çift-sarmallı DNA moleküllerinin azalmıĢ elektroforetik hareketine bağlıdır.

5.5.5 DNA dizi analizi

Türlerin birbirinden ayırt edilmesi için, klasik PCR ile 16S rRNA genlerinin çoğaltılmasından sonra, DGGE analiziyle türler birbirinden ayırt edilmiĢtir. Dizi analizi için seçilen klonların miktarı PCR ve DGGE analizleri sonunda belirlenmiĢtir. PCR ya da DGGE jellerinde

görüntülenen bandlar, uygun saflaĢtırma kitleri kullanılarak saflaĢtırılmıĢtır. Bu ürünler daha sonra “dye terminator cycle sequencing” reaksiyonuna sokularak floresan iĢaretli fragmanların amplifikasyonları gerçekleĢtirilmiĢtir. Elde edilen ürün saflaĢtırılmıĢ ve formamid çözeltisi içinde süspanse edilmiĢtir. Dizi analizleri için Beckman Coulter marka CEQ 8000 model Genetik Analiz Sistemi kullanılmıĢtır. Analiz verileri, A-G-C-T dizin dosyaları biçiminde kopyalanarak, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ internet sitesinde BLAST programında değerlendirmeye alınarak değerlendirilmiĢtir. Moleküler analiz yöntemlerinin uygulama akıĢ Ģeması ġekil 5.11 de verilmiĢtir.

ġekil 5.11 Moleküler analiz yöntemlerinin uygulama akıĢ Ģeması.

Üçüncü deneme olan statik yığın çalıĢmalarında, biyokatıların biyolojik stabilizasyonunda rol alan mikrobiyal türlerin PCR (polimeraz Zincir Reaksiyonu)-DGGE (Denature Gradyan Jel

Elektroforezi) temelli moleküler tekniklerle belirlenmesi amacıyla yığınlardan farklı sıcaklıklarda alınan numunelerde mikrobiyal türlerin belirlenmesi iĢlemi gerçekleĢtirilmiĢtir. Elde edilen DGGE profilinde her bant bir mikrobiyal türü temsil etmektedir. Bazen bazı bantların uzantısı da aynı türü temsil edebilir. Bu durumu netleĢtirebilmek ve bandların mikrobiyal tür tanımlamalarını yapabilmek için 16S rRNA genlerinin sekans analizleri gerçekleĢtirilmiĢtir.