Ertelenen Verginin Hesaplanmasına İlişkin Esaslar

3.2.1 Eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS da CaBo

O monitoramento do processo de purificação e a estimativa da massa molecular aparente das subunidades da lectina purificada foram realizados por meio de eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS (SDS-PAGE), de acordo com o protocolo estabelecido por Laemmli (1970) com algumas alterações.

O gel de separação ou corrida (main gel) foi montado a uma concentração de 12,5% preparado em tampão Tris-HCl 0,1 mol/L pH 8,8, contendo SDS 1%, TEMED 0,04% e persulfato de amônio 0,1%. O gel superior ou de aplicação (Stacking gel) foi preparado usando acrilamida/bisacrilamida 4% em tampão Tris-HCl 0,1 mol/L pH 6,8, SDS 1%, persulfato de amônio 0,1% e TEMED 0,04%.

O extrato protéico total e as amostras liofilizadas oriundas dos dois passos cromatográficos foram solubilizadas a uma concentração de 4 mg/mL em tampão de amostra contendo Tris-HCl 0,0625 mol/L pH 6,8, 10% de glicerol, 0,02% de azul de bromofenol e 1% de SDS. Foram aplicados 40 μg da proteína em cada poço.

A corrida eletroforética foi realizada em sistema Mini-Protean II mini-gel (Bio- Rad; Milão, Itália) com a voltagem variando até 150 V, potência até 10 W e amperagem constante de 25 mA. O tampão de corrida utilizado continha Tris 0,025 mol/L, Glicina 0,192 mol/L e SDS 0,1% pH 8,8. Os marcadores de massa molecular utilizados foram: BSA (66 kDa) e ConBr (25, 14 e 12 kDa). O gel foi corado em Coomassie R-250 a 0,05%, dissolvido em metanol, ácido acético e água a uma proporção 1:3,5:8 (v/v/v). A retirada do excesso do corante (descoramento) foi feita com solução descorante contendo 40% de metanol e 20% de ácido acético.

3.2.2 Efeito da temperatura sobre a atividade hemaglutinante da CaBo

Alíquotas da CaBo, a uma concentração de 1 mg/mL foram separadas em tubos de microcentrífuga, diluídas em solução de NaCl 0,15 mol/L, centrifugadas e o sobrenadante resultante foi utilizado para determinar a termoestabilidade da lectina. Em seguida, cada amostra foi submetida a diferentes temperaturas variando de 40 ºC a 80 ºC por 60 minutos.

Após o término, foi avaliada a atividade hemaglutinante da CaBo com todas as amostras. Cada amostra foi testada em duplicata.

3.2.3 Efeito do agente quelante (EDTA) sobre a atividade hemaglutinante da CaBo

A avaliação da dependência da atividade hemaglutinante da CaBo por diferentes cátions divalentes foi analisada. Para tal fim, uma alíquota da lectina (1 mg/mL) foi solubilizada em NaCl 0,15 mol/L e dialisada contra soluções de EDTA 0,05 mol/L contendo NaCl 0,15 mol/L por 48 horas, seguida pela diálise exaustiva contra NaCl 0,15 mol/L por mais 24 horas para retirada do excesso de EDTA. Após isto, a atividade hemaglutinante foi testada pela adição de 100 μL de soluções de NaCl 0,15 mol/L contendo CaCl2, MnCl2,

separadamente, a uma concentração de 0,01 mol/L em tubos de ensaio, onde em seguida foram feitas diluições seriadas em duplicata a partir da adição de 100 μL da lectina (1 mg/mL), acrescentadas 100 μL de eritrócitos tripsinizados de coelho a β% em cada tubo e levadas a incubação por 1 hora.

3.2.4 Efeito do pH sobre a atividade hemaglutinante da CaBo

A CaBo foi solubilizada em NaCl 0,15 mol/L (1 mg/mL) e foram feitas diluições seriadas contra diferentes soluções tampão com pH variando de 4,0 a 10,0 contendo NaCl 0,15 mol/L. Os seguintes tampões foram utilizados: acetato de sódio 0,1 mol/L pH 4,0 e 5,0, citrato de sódio 0,1 mol/L pH 6,0, fosfato de sódio 0,1 mol/L pH 7,0, Tris-HCl 0,1 mol/L pH 8,0, glicina-NaOH pH 9,0 e 10,0.

3.2.5 Determinação da massa molecular intacta da CaBo por espectrometria de massas

A massa molecular da CaBo foi determinada através da técnica de espectrometria de massa com ionização por MALDI e análise por tempo de vôo (TOF) utilizando um instrumento híbrido (Autoflex Speed, Bruker Daltonics, USA). Para tal, a proteína foi solubilizada em uma solução contendo 50% de acetonitrila e 0,3% de TFA, a uma concentração final de aproximadamente 1 pmol de proteína. Foi utilizada a matriz ácido α-4-

ciano-hidroxicinamico a 10 mg/mL solubilizada em 50% ACN e 0,3% TFA. A proporção

matriz/analito para a análise foi 3:1. O instrumento operou com voltagem de 20 kV com refletor em modo linear e com análise de proteínas na faixa de 10.000 a 100.000 Da. Os

espectros adquiridos foram processados com software CompassTM 1.3 usando o algoritmo SNAP para a anotação de pico monoisotópico.

3.2.6 Digestão in gel e sequênciamento dos peptídeos da CaBo por espectrometria de massas

A digestão e extração dos peptídos seguiram o protocolo descrito em Shevchenko

et al. (2007). A CaBo foi aplicada em um gel de poliacrilamida 12% (SDS-PAGE). As bandas

referentes à proteína foram retiradas do gel e recortadas com auxilio de uma ponteira plástica. O gel de eletroforese contendo a proteína de interesse foi descorado em uma solução de 50% de acetonitrila contendo 0,1 mol/L de bicarbonato de amônio, desidratado em 100% de acetonitrila e seco em Speedvac (LabConco). O gel foi então reidratado em uma solução de 0,05 mol/L de bicarbonato de amônio contendo a enzima tripsina (Promega) na proporção de 1:50 (p/p; enzima:substrato). A reação de digestão permaneceu overnight a 37 ºC, sendo parada com a adição de ácido fórmico a 5%.

Os peptídeos oriundos da digestão foram extraídos do gel utilizando uma solução de 5% de ácido fórmico em 50% de acetonitrila sob agitação durante 15 minutos. Este procedimento foi repetido por 3 vezes, o sobrenadante contendo os peptídeos extraídos foram unidos e concentrados em Speedvac e o volume foi ajustado para 25 μL com ácido fórmico 0,1%. Estes peptídeos foram injetados em um sistema nanoacquit (Waters Corp.) conectado a uma fonte de nanoeletrospray do espectrômetro de massas (SYNAPT HDMS – Waters Corp.). A amostra foi aplicada em uma coluna de fase reversa C18 (75 μM x 100 μM) e eluída em um gradiente de acetonitrila de 10% a 85% contendo 0,1% de ácido fórmico.

O espectrômetro de massas operou em modo positivo, com a temperatura da fonte de 90 ºC e a voltagem do capilar de 3.0 kV. Os experimentos de LC-MS/MS foram realizados de acordo com a função DDA (Data Dependet Aqusition – Aquisição Dependente de Dados) os íons precursores com carga entre [M+H]+2 _{e [M+H]}+3 _{foram selecionados para análise de}

MS/MS sendo fragmentados através de CID (Collision Induced Decomposition – Dissociação induzida por colisão). Os dados foram coletados, processados e analisados utilizando o programa MassLynx v4.1 (Waters Corp.) e ProteinLynx v2.4 (Waters Corp.). Os peptídeos comuns a outras proteínas foram identificados por buscas em banco de dados utilizando ferramenta de pesquisa por padrão de fragmentação dos peptídeos nos programas ProteinLynx 2.4 (Waters Corp.) e MASCOT (Matrix Science). Para os demais peptídeos, as sequências

foram determinadas através da interpretação manual dos espectros de fragmentação (sequênciamento De Novo).

3.3 Clonagem molecular da lectina da Canavalia bonariensis

3.3.1 Extração de DNA genômico

O ácido desoxirribonucleico (DNA genômico) foi isolado a partir de folhas frescas da planta, utilizando-se o método baseado no detergente brometo de cetiltrimetilamonio (CTAB), descrito por Doyle & Doyle (1987), modificado.

As folhas congeladas foram maceradas com nitrogênio líquido até a obtenção de um pó fino. O macerado (aproximadamente 0,8 g) foi transferido para um tubo de fundo cônico de 15 mL contendo 8 mL de tampão de extração CTAB (Tris 100 mM pH 8,0; CTAB 2%; NaCl 1,4 mol/L; EDTA 0,02 mol/L; 2- mercaptoetanol 0,2% v/v) contendo de 1% de PVP (polivinilpirrolidona) (0,08 gramas, p/v) pré-aquecido a 60°C, o qual permaneceu em incubação por 1 hora a 60 °C, sendo homogeneizado a cada 10 minutos. A emulsão foi centrifugada por 20 minutos a 10.000 x g e a 4°C.

O sobrenadante foi transferido para um novo tubo falcon onde foi adicionado 1 volume de clorofórmio:álcool isoamílico (24:1, v/v), que permaneceu em agitação suave por 5 minutos. A emulsão foi novamente centrifugada. Após a centrifugação a fase aquosa foi coletada e transferida para um novo tubo de fundo cônico e foi adicionada a esta 0,3 volumes de isopropanol. O tubo foi invertido gentilmente e incubado no freezer -20 °C por 30 minutos.

A mistura foi centrifugada para a precipitação do DNA genômico por 10 minutos, a 10.000 x g. O sobrenadante foi descartado e o precipitado lavado com 1 mL de etanol 70%. O DNA foi recolhido e transferido para um microtubo e foi realizada outra centrifugação por 10 minutos, a 10.000 x g e a 4°C. O sobrenadante foi descartado e o tubo foi mantido aberto à temperatura ambiente até total evaporação do álcool. O DNA isolado foi ressuspendido em 50 μL de água ultrapura estéril e estocado em geladeira a 4 °C.

O DNA extraído foi submetido à eletroforese em gel de agarose a 1% contendo 0,5 μg/mL de brometo de etídio (EtBr) para análise de sua integridade. A corrida eletroforética foi submetida a uma voltagem constante de 100 V, e o gel submerso em tampão de corrida TBE (Tris-Borato 0,09 mol/L, pH 8,8, contendo EDTA 0,002 mol/L). O DNA será visualizado através de exposição do gel à iluminação ultravioleta utilizando um transluminador.