Enzim İmmobilizasyonu Yöntemleri

Taşıyıcı bir yüzey üzerine bağlama bilinen en eski enzim immobilizasyon yöntemidir. Bu yöntemde bağlanan enzim miktarı ve immobilize enzim aktivitesi taşıyıcı yüzeyin özelliklerine bağlıdır. Şekil 22’de taşıyıcı yüzey üzerine bağlı enzim molekülünü şematize edilmektedir.

Şekil 22. Taşıyıcı yüzeye bağlı enzimin şematik gösterimi

Taşıyıcı yüzey seçilirken enzimin bazı özellikleri dikkate alınmalıdır. Bunlar aşağıdaki gibi sıralanabilir.

• Partikül büyüklüğü • Yüzey alanı

• Hidrofilik ve hidrofobik grupların molar oranı • Kimyasal bileşim

Genel olarak hidrofilik grupların oranı ve enzim miktarındaki artış, immobilize enzimin daha yüksek aktiviteye sahip olmasıyla sonuçlanmaktadır. Enzim immobilizasyonu için yaygın olarak kullanılan taşıyıcı yüzeyler arasında selüloz, dekstran, agaroz ve poliakrilamid jel bulunmaktadır (33). Bağlanma şekline göre, taşıyıcı yüzey üzerine bağlama yöntemleri çeşitlilik göstermektedir.

Fiziksel Adsorbsiyon

Bu method, enzim proteininin suda çözünmeyen bir taşıyıcı üzerine fiziksel adsorbsiyonunu temel almaktadır. Enzim molekülünde ve aktif bölgede hemen hemen hiçbir hasara ve konformasyonal değişime yol açmayan bir immobilizasyon yöntemidir. Eğer uygun bir

taşıyıcı yüzey üzerinden ayrılabilmektedir. Enzimlerin fiziksel adsorbsiyonu için uygulanan bazı yöntemler aşağıdaki gibidir.

• Statik işlem • Elektro-boşalım • Reaktörde bekletme

• Çalkalama ya da karıştırma banyosunda bekletme

Genel bir immobilizasyon methodu olan adsorbsiyonun, ana avantajı bağlama için kimyasal madde kullanılmaması ve aktivasyon için minimum basamağa ihtiyaç duyulmasıdır. Adsorbsiyon kimyasal bağlama yöntemlerine göre enzim proteinine daha az zarar vermektedir. Çünkü adsorbsiyonda bağlanma, hidrojen bağları, çoklu tuz köprüleri ve Van der Waal’s kuvvetleriyle olmaktadır. Oluşan zayıf bağlardan dolayı ortam pH’sının, sıcaklığın, iyonik kuvvetlerin değişimiyle ve substrat varlığıyla enzim proteininin taşıyıcı yüzey üzerinden desorbsiyonu gözlenmektedir. Bir diğer dezavantaj ise, çok spesifik bir yöntem olmamasından dolayı, diğer proteinlerin ve maddelerin immobilize edilecek enzim gibi kullanılmasıdır. Bu durum immobilize enzimin özelliklerini değiştirmekte ve reaksiyon hızını düşürmektedir (33).

İyonik Bağlama

İyonik bağlama yöntemi, enzim proteininin suda çözünmeyen iyon değişimini sağlayan maddeler içeren bir taşıyıcı yüzey üzerine iyonik olarak bağlanmasına dayanmaktadır. İyon değişim merkezleri içeren polisakkaritler ve sentetik polimerler, bu amaçla yaygın olarak kullanılmaktadırlar. Enzimin taşıyıcı yüzey üzerine bağlanması kovalent bağlamada olduğu gibi ortam koşullarına çok bağlı olmadığından kolaylıkla gerçekleştirilebilmektedir. Ayrıca bu yöntem konformasyonda ve enzimin aktif bölgesininde çok az değişime sebep olmaktadır. Bu sebeple yüksek aktivite görülmektedir. Enzimin taşıyıcı yüzey üzerinden ayrılması gibi durumlar yüksek iyonik kuvvete sahip substrat çözeltilerinde ve pH değişimlerinde olmaktadır. Bunun sebebi, taşıyıcı yüzey ile enzim arasında oluşan bağlayıcı kuvvetlerin kovalent bağlamada olduğu kadar kuvvetli olmamasıdır.

İyonik bağlanma ve fiziksel adsorbsiyon arasındaki ana fark iyonik bağlamada taşıyıcı yüzey ile oluşturulan bağların daha kuvvetli olmasıdır (33).

Kovalent Bağlama

Kovalent bağlama, enzim ve taşıyıcı matriks arasında kovalent bağların oluştuğu, en sık kullanılan immobilizasyon yöntemidir. Proteinin immobilize edileceği reaksiyon tipi seçilirken,

1) Bağlanma reaksiyonunun gerçekleştiği koşullarda enzim aktivitesinin kaybolmamasına, 2) Kullanılan kimyasallardan dolayı enzimin aktif bölgesinin etkilenmemesine dikkat edilmelidir.

Kovalent bağlama yöntemi, enzim ve suda çözünmeyen bir taşıyıcı yüzeyin, kovalent bağlanması temeline dayanmaktadır. Bu bağlama yönteminde oluşabilecek bazı fonksiyonel gruplar karboksil, amino, hidroksil ve sülfidril gruplarıdır.

Oluşan bağlara göre bu yöntem, diazo, peptid ve alkilasyon yöntemleri gibi alt gruplara ayrılabilir. Kovalent bağlama fiziksel adsorbsiyon ve iyonik bağlama gibi yöntemlere göre daha komplekstir ve immobilizasyon için gerekli şartlar daha fazladır. Bu sebeple kovalent bağlama enzimin konformasyonunu değiştirebileceği gibi, enzimin aktif bölgesini de etkileyerek aktivite kaybına sebep olabilir. Ancak enzim ve taşıyıcı yüzey arasındaki bağlanma kuvvetleri çok güçlü olduğundan, yüksek iyonik güçteki bir çözeltide bile enzimin taşıyıcı yüzey üzerinden desorbsiyonu gibi bir durum kovalent bağlamada söz konusu olamaz. 3.2.1.2 Çapraz Bağlama

Bu yöntemde enzim immobilizasyonu, enzim proteinlerinin diğer protein moleküllerine ya da fonksiyonel gruplara moleküller arası çapraz bağlanmasıyla gerçekleşir. Enzim moleküllerinin birbirlerine çapraz bağlanması, hem pahalı hem yetersiz bir yöntemdir çünkü protein molekülleri ana destek maddesi yerine geçeceklerdir. Bu da düşük enzim aktivitesine sebep olacaktır. Genel olarak çapraz bağlama, diğer yöntemlerle sıkça kullanılmaktadır. Özellikle adsorbe olmuş enzimlerin kararlılığını sağlamak için ve poliakrilamid jellerden enzimin ayrılmasını engellemek için kullanılır. Şekil 23’de çapraz bağlı enzim molekülü şematik olarak gösterilmiştir.

Çapraz bağlamada en sık kullanılan bağlayıcı ajan gluteraldehittir. Bağlanma reaksiyonları ağır koşullarda gerçekleşir. Bu koşullar enzimin aktif bölgesinde konformasyon değişikliklerine yol açabileceği gibi enzim aktivitesine de sebep olabilmektedir. Şekil 24’de glutaraldehite (GA) ait kimyasal yapı gösterilmektedir.

Şekil 24. Glutaraldehite ait kimyasal yapı

3.2.1.3 Tutuklama

Enzim tutuklama yöntemi, enzim molekülünün polimer ya da membran matrisinin örgü yapısının içerisine lokalizasyonunu temel almaktadır. Bu tutuklama işlemi, enzim substratının difüzyonuna izin verecek şekilde yapılır. Difizyonu sağlayan bu yapı kafes (lattice) ve mikro kapsül olmak üzere ikiye ayrılır. Şekil 25’de tutuklanmış enzim molekülleri şematik olarak gösterilmiştir.

Şekil 25. Tutuklanmış enzimlerin şematik gösterimi

Bu yöntem, enzimin bir jel ya da membran matrisine bağlanmamasından dolayı kovalent bağlama ve çapraz bağlamaya göre farklılık göstermektedir. Bu da geniş kullanım alanı sağlamaktadır. Ancak kimyasal polimerizasyon reaksiyonlarında, uygulanan koşullar enzim aktivitesini düşürebilmektedir. Bundan dolayı enzim immobilizasyonu için uygun koşulların sağlanması çok önemlidir.

3.3 Enzim Kinetiği