Enzim Elektrodu

Enzim elektrodu, üzerine ince bir tabaka halinde enzim modifiye edilmiş elektrokimyasal bir sensördür (37). Genellikle enzim tabakası ve çözelti arasına, enzim tabakası ve elektrot arasına ya da ikisi arasına da yarı geçirgen bir membran modifiye edilmişitir. Örnek, herhangi bir ön işleme tabi tutulmadan, direk olarak ölçüm yapılır. Prob, analit çözeltisiyle temas ettiğinde substrat enzim tabakasının içine doğru difüzlenir. Birçok enzimatik reaksiyon sonucunda elektrotla ölçülebilen üretilen ya da tüketilen türler olur. Enzimatik reaksiyonun sonucu olarak, substrat ve ürün konsantrasyonu değişir ve belirli bir süre sonunda ürün üretimi ve substrat tüketimi hızının eşit olduğu kararlı konuma ulaşılır. Elektroaktif türlerin konsantrasyonları potansiyometrik ya da amperometrik olarak kontrol edilir ve elektrokimyasal sinyal, substrat konsantrasyonunun ölçülmesi için ilişkilendirilebilir (28). Enzim elektrotlarının en temel iki unsuru enzim ve elektrot materyalidir. Enzim elektrodunda, elektrot materyali seçilirken elektriksel iletkenlik ve sertliğe önem verilmelidir. Bu sebeple, enzim elektrotlarda kullanılan elektrotlar genelde yaprak ya da çubuk şeklinde; platin, altın karbon gibi katı destek materyallerinden oluşturulmaktadır.

billirubin oksidaz ve laktat oksidaz bu enzimlerden bazılarıdır. Enzim modifiye edilmiş elektrot sistemleri çok bileşenli sistemlerde hızlı analize imkan tanıdıklarından ve yüksek hassasiyette ölçüm yapmalarından dolayı çevre, tıp, analitik kimya gibi alanlarda uygulama alanı bulmaktadır.

Enzim bazlı bir amperometrik elektrot, kimyasal seçici tabaka olarak bir enzimden, çevirici olarak bir elektrottan, elektrodun bağlı olduğu bir amplifikatörden ve sonuçların okunacağı bir ekrandan oluşur (39) (Şekil 29).

Şekil 29.Bir enzim elektrodunun temel elemanları 3.5.1 Amperometrik Enzim Elektrodu Jenerasyonları

Amperometrik biyosensörlerin tasarımı için, redoks enzimi ve elektrotlar arasındaki elektronik bağlantı; enzim substratının ya da ürünün elektroaktivitesini (I.nesil), redoks medyatörlerinin serbest halde ya da immobilize olarak biyomolekülle kullanımını (II. nesil), ya da enzimin redoks aktif bölgesi ile elektrot yüzeyi arasında direk elektron transferini (III. nesil) baz alır. Şekil 30’da amperometrik elektrotların gelişimindeki farklı yaklaşımlar, şematik olarak gösterilmektedir (40).

Şekil 30. Amperometrik enzim elektrodu jenerasyonları a) I. Nesil Amperometrik elektrotlar, b) II. Nesil Amperometrik elektrotlar, c) III. Nesil Amperometrik

elektrotlar

I. Nesil biyosensörlerde çok yüksek potansiyel uygulanması, en büyük eksikliktir. Bu sorun küçük redoks aktif moleküller olan, enzimin redoks aktif merkezi ile elektrot yüzeyi arasında elektron transferini sağlayan medyatörlerin (ferrosen türevleri, ferrosiyanid, iletken organik tuzlar ve kinonlar) kullanılmasıyla aşılmaktadır (II. Nesil). Birçok redoks enzimi bazlı elektrotlar için medyatörlerin kullanımı uygulanan potansiyeli düşürür. Buna ek olarak, medyatörler kullanıldıkları elektrotlarda lineer cevap aralığını arttırmaktadır. Ayrıca glukoz elektrotlarında, tahmin edilen elektrot ömrünü uzatırlar çünkü enzim için zararlı olan hidrojen peroksit medyatör kulanıldığı durumda üretilmemektedir. Ne yazık ki, medyatörler sadece redoks enzimleri ile bağlanarak enzim ve elektrot arasında elektron transferini sağlamaz aynı zamanda çeşitli reaksiyonlara da sebep olurlar (41).

Redoks medyatörlerinin elektrot ve enzim molekülleri arasında kullanımı için birçok yaklaşım bulunmaktadır. Ancak, uygulanan birçok immobilizasyon yönteminin kinetik açıdan dezavantajları bulunmaktadır. Kinetik kısıtlamaların çoğu, enzim ve medyatörün elektrot yüzeyine asimetrik yüklenmesi ve immobilize konumda medyatörün hareketliliğinin kısıtlanmasından kaynaklamaktadır. Tasarlanan elektrot kullanılmadan önce, enzim medyatör oranı sabittir ancak elektrokimyasal işlem boyunca bu oran immobilize formdaki medyatörün anyonik ve katyonik formlarının stabilitesine bağlı olarak değişmektedir. Bu değişim sebebi, elektron medyatörlerinin çözünürlüğüdür (42).

Uygulanan immobilizasyon yaklaşımlarının tümünün hedefi, redoks medyatörlerinin çözünürlüğünden dolayı elektrot yüzeyinden desorbe olmasını önlemektir. Bu amaçla, redoks medyatörlerinin elektrot yüzeyine absorbe ve immobilize edilmesi de medyatörlerin çözünürlük sorununu tamamen çözememektedir. Son yıllarda yapılan çalışmalar redoks medyatörlerinin iletken polimerler ve iyon-değişimli membranlarla birlikte kullanılmasının bu sorunu büyük oranda çözdüğünü göstermektedir (43).

III. Nesil biyosensörlerde elektron transferi substratın ürüne katalitik dönüşümüyle ilgilidir. Redoks enzimi elektrot ve substrat molekülü arasında medyatör olmadan elektron transferini arttırarak, bir elektro katalizör görevi görür. Bu tür biyosensörler, genellikle daha iyi seçicilik gösterirler, çünkü başka reaksiyonlara sebep olmadan enzimin redoks potansiyeline yakın

yüksek performanslı amperometrik biyosensörler için redoks enzimi ve elektrot arasında elektron transferinin geliştirilmesi üzerine yoğunlaşmıştır. Bu sistemlerin başka bir geleceği ise, direk elektron transferine dayalı enzim bazlı amperometrik cihazlara dayanmaktadır (40). 3.5.2 Enzim Elektrodu Karakteristikleri

Bir enzim elektrodunun kullanılabilirliğine, karakteristik özelliklerinin belirlenmesinden sonra karar verilebilir.

3.5.2.1 Kararlılık

Kararlılık, bir enzim elektrodunun pratik kullanım açısından uygunluğunu belirlediği gibi, elektrodun raf ömrünü de belirler. Uzun ömürlü bir elektrot ile çok sayıda analiz yapılabileceği için maliyet açısından avantajlıdır. Elektrot ömrü, çalışma ve depolama koşulları açısından incelenmektedir. Depolama ve kullanım sürecindeki elektrot ömrü farklılık göstermektedir.

Enzimin immobilizasyon yöntemi, saflık derecesi ve kaynağı gibi faktörler enzim ve elektrodunun kararlılığını etkileyen önemli parametrelerdir. Örneğin, fiziksel yöntemlerle immobilize edilen bir enzim elektrodunun ömrü kimyasal olarak immobilize edilmiş bir enzim elektroduna göre daha kısadır (44).

3.5.2.2 Seçicilik

Kullanılan elektrodun yüksek seçiciliğe sahip olmasıi bir enzim elektrodundan beklenen en temel özelliktir. Enzimler genel olarak antikor ve nükleik asitlerden sonra seçicilik sıralamasında yer almalarına karşı, mutlak özgül enzimler söz konusu olduğunda bu durum geçersizdir. Seçicilik üzerine etki eden başlıca parametreler pH, sensördeki girişimler ve biyokatalizördeki girişimlerdir. Girişimi engellemenin en iyi yolu sadece analiz edilecek maddeye spesifik bir biyokatalizör kullanmaktır.

Amperometrik enzim elektrotları, potansiyometrik elektrotlara göre daha seçicidirler ancak yine de çalışma potansiyelinde girişimde bulunan elektroaktif maddeler bulunabilir.

Seçiciliği etkileyen bir diğer faktör ise, kendi içerisinde yarışmalı substratlar ve enzimi aktive ya da inhibe eden maddeler olarak ayrılan biyokatalizördeki girişimdir. Eğer kullanılan enzim alkol oksidaz gibi grup özgüllüğüne sahip bir enzim değil de, yalnızca bir substratla tepkime verme özelliğine sahip bir enzim ise, yarışmalı bir başka substrat girişimi söz konusu olamaz. Ortamdaki inhibitör ve aktivitörler de enzim aktivitesini etkilemektedir. Ag+

metal iyonları, tiyol bileşikleri ve organofosfatlar da birçok enzimin aktif bölgesinde yer alan serbest tiyol gruplarını inhibe eden önemli inhibitörlerdendir.

Seçiciliği etkileyen bir diğer değişken ise, ortam pH’dır. Enzimin optimum çalıştığı pH, immobilizasyon sonucu ve yüklü substrat varlığı gibi durumlarda kaymalar gösterebilir. Bu nedenle elektrodun çalışacağı optimum pH, teorik zorlamalara göre değil, deneysel çalışmalara göre belirlenmelidir. Ölçüm aralığının da seçicilik üzerine önemli etkisi bilinmektedir. Hedef substratın dışında girişimde bulunabilecek maddelerin elenmesi için, düşük değerlere inebilen bir ölçüm aralığına sahip elektrotta, örnekteki hedef madde seyreltilerek girişimde bulunabilecek maddelerin konsantrasyonları ölçüm sınırları dışına çıkarılabilir (44).

3.5.2.3 Cevap Süresi

Cevap süresi, elektrodun analizlenecek madde ortamına değmesinden, ölçme sisteminden sonucun okunmasına kadar geçen süre anlamına gelmektedir. Cevap süresinin kısa olması, bir enzim elektrodundan beklenen temel özelliklerden biridir. Özellikle rutin analizlerde, kısa cevap süresi pratiklik açısından büyük önem taşır. Genellikle bir biyosensörün cevap süresi birkaç saniye ile birkaç dakika arasında değişir.

Bir enzim elektrodunun cevap süresini etkileyen faktörler; • Substratın zar yüzeyine difüzyon hızı

• Substratın biyokatalizörün aktif bölgesi ile verdiği tepkimenin hızı • Oluşan ürünün elektrot yüzeyine difüzyon hızı

Bu üç faktorü de etkileyen unsurlar substrat konsantrasyonu, enzim derişimi, sıcaklık, pH, karıştırma hızı, biyoaktif tabaka üzerinde zar kullanılıp kullanılmadığıdır. Bu etkenlerden optimum pH ve sıcaklık, karıştırma cevap süresini kısaltırken, substrat derişimdeki artış, biyoaktif tabaka üzerinde zar bulunması, cevap süresinin uzamasına yol açar (44).