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As análises cromatográficas de MPA e de seus candidatos a padrão interno foram realizadas em coluna Shodex C18 (150 x 4,6 mm; 5 m) a 40 °C. A vazão da fase móvel foi 1 mL/min. A composição e proporção dos solventes na fase móvel foram otimizadas de modo a obter sinais de alta intensidade no espectrômetro de massas e tempo de corrida curto.

Para otimizar o sinal e a separação cromatográfica, uma solução contendo MPA, naproxeno, nevirapina e cetoprofeno, todos a 250 ng/mL, foi injetada em diferentes constituições de fase móvel. Os parâmetros área do pico do MPA, tempo de retenção e formato dos picos foram avaliados para se escolher a melhor fase móvel.

Para a ionização do MPA no modo ESI(+), foram testadas algumas composições de fases aquosas contendo ácido. Ácido acético e acido fórmico nas proporções de 0,025%, 0,05%, 0,1%, foram testados isoladamente. Ácido fórmico e formiato de amônio na proporção 0,025% e 2 mM, respectivamente, também foi uma fase aquosa testada. Todas essas fases aquosas foram testadas em diferentes proporções utilizando metanol ou acetonitrila para compor a fase orgânica.

Percebeu-se que a acetonitrila melhora a ionização do MPA resultando em sinais mais intensos. Contudo, os formatos dos picos com a utilização do metanol ficam muito mais simétricos. Uma vez que o ganho de sinal com acetonitrila em relação ao metanol não eram tão acentuados, deu-se preferência pelo uso do metanol visto que a melhor

simetria dos picos também é um fator importante no momento da integração, além de o metanol ser um solvente menos oneroso.

Como na cromatografia acoplada à espectrometria de massas cada fármaco é detectado por meio de uma transição distinta, não é necessário obter resolução de linha base entre os picos no cromatograma, o que também contribui para obtenção de tempos de corrida curtos. Entretanto, é imprescindível avaliar a interferência de constituintes da matriz que coeluem com os fármacos de interesse, que podem suprimir ou induzir a ionização dos mesmos. Nesse caso, as condições cromatográficas devem ser alteradas, visando a separação adequada entre picos de interesse e os interferentes em potencial.

A presença de ácido acético 0,1% na fase aquosa, dentre todas as testadas, foi a que mais aumentou o sinal do MPA e conferiu simetria aos picos. A proporção entre metanol e acido acético 0,1% foi otimizada em (8:2) para se conseguir uma boa retenção capaz de separar os fármacos dos constituintes da matriz que por ventura também possam ser extraídos. Uma proporção de metanol mais elevada na fase móvel é desejável para obtenção de sinais de alta intensidade e tempo de corrida curto. Nessa condição, o método foi finalizado obtendo-se um tempo de corrida de 4,5 minutos.

Após o estabelecimento da condição cromatográfica capaz de determinar os fármacos, procedeu-se um teste de comparação para selecionar qual seria o melhor padrão interno para a análise. A nevirapina ficou menos retida na coluna e seu comportamento não foi muito constante nessas condições, pois em alguns momentos o pico se deformou. O naproxeno apresentou bons resultados e boa semelhança com o MPA durante a cromatografia e provavelmente seria um bom fármaco para se utilizar como padrão interno na análise. Contudo, o fármaco selecionado para ser o padrão interno do método foi o cetoprofeno. Esse fármaco apresentou maior sinal cromatográfico e uma resposta mais próxima à do analito principal durante a cromatografia, na qual os dois picos praticamente coeluiram. Na Figura 3.5, são mostrados os espectros de massas com e sem fragmentação do MPA e do cetoprofeno. Um cromatograma típico de uma corrida analítica é mostrado na Figura 3.6.

Figura 3.5 – Espectros de massas com e sem fragmentação para: (A) MPA e (B) cetoprofeno. (A) (B) HOOC O CH3 H3CO CH3 OH O +

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Figura 3.6 – Cromatograma de uma corrida analítica do método

Com a condição cromatográfica estabelecida e o padrão interno escolhido, vários procedimentos de extração foram avaliados para se dar prosseguimento ao método. Um fator limitante do método de extração foi a pequena quantidade de vítreo que se dispunha. Não é possível retirar mais do que 1 mL de vítreo de cada animal, sendo que, em alguns casos, pouco mais 500 L foram conseguidos. Logo, tomadas de amostra com volumes grandes (maiores que 200 L) seriam arriscadas, uma vez que, caso fosse necessário fazer uma reanálise, provavelmente não haveria volume de amostra suficiente.

Inicialmente, foi testado um método por precipitação de proteínas no qual 25 µL de solução de padrão interno eram adicionados a 100 µL de amostra de vítreo, seguido de agitação por 10 segundos em vórtex. Como a fase móvel era constituída em sua maioria por metanol (80%), utilizou-se primeiro o metanol como agente precipitante. Adicionou-se 375 µL de metanol à solução e agitou-se em vórtex por 1 minuto. Após

centrifugação a 14000 rpm por 5 minutos, o sobrenadante foi retirado e colocado em vial com insert. Injetou-se 20 µL do sobrenadante no cromatógrafo.

Esse procedimento originou bons resultados, mas foi repetido substituindo-se o metanol por acetonitria ou acetona, em busca de resultados ainda melhores. A todos os agentes precipitantes avaliados, a adição de ácido fosfórico ou hidróxido de amônio a 10% (v/v) foi testada. O objetivo foi tentar promover uma extração maior do analito e/ou obter extratos mais limpos.

Nas extrações com acetonitrila ou acetona, houve problemas durante a cromatografia. O que se observou foi uma deformação dos picos dos fármacos, provavelmente por uma alteração na força do solvente da fase móvel quando esses solventes presentes no sobrenadante extraído eram injetados. A adição de uma base com o metanol durante a extração diminuiu consideravelmente a recuperação dos analitos enquanto a adição de ácido não alterou em nada a recuperação. Logo, o melhor procedimento testado foi o primeiro.

O procedimento de extração por precipitação de proteínas acaba por diluir a amostra. No primeiro caso, 100 µL de vítreo foram diluídos com 25 µL de padrão interno e 375 de agente precipitante (diluição de quatro vezes). Um novo teste foi feito visando conseguir sinais mais intensos diluindo-se menos a amostra, mas sem prejudicar a precipitação. Adicionou-se 275 µL de metanol como agente precipitante em vez de 375 µL, o que resultou em uma diluição de três vezes. Os resultados apresentaram sinais mais intensos e um sobrenadante igualmente límpido em relação ao primeiro, ou seja, sem prejuízo na precipitação. Dessa forma, o procedimento de extração otimizado foi:

- 100 µL de vítreo.

- Adição de 25 µL de solução de padrão interno. - Vortex por 10 segundos.

- Adição de 275 µL de metanol. - Vortex 60 segundos

- Retirar 300 µL do sobrenadante.

O método de extração se mostrou simples, rápido e robusto, o que favorece a aplicação em procedimentos nos quais muitas amostras serão processadas.