4. MONTAJ VE DEMONTAJ DĠZAYNI
4.2. Demontaj(Sökme)-Dfd Dizaynı
Cistatinas recombinantes de cana-de-açúcar foram testadas como inibidores das catepsinas K, S e V recombinantes. Neste ensaio foi utilizado Z- Phe-Arg-MCA. Na Tabela 1 estão apresentados os valores de Ki aparente.
Os resultados mostram que todas as cistatinas utilizadas são potentes inibidores das catepsinas testadas. CaneCPI-2 e CaneCPI-4 foram capazes de inibir Catepsina V na ordem de nM (0,014 e 0,009 nM, respectivamente). Catepsinas S e K foram inibidas por todas as cistatinas na ordem de µM.
Tabela 1: Ação inibitória de cistatinas recombinantes de cana-de-açúcar sobre a atividade catalítica das catepsinas K, S e V sobre o substrato Z- FR-MCA
Cistatina Ki (µµµµM)
Cat K Cat S Cat V
CaneCPI-2 3,52 0,28 0,014
CaneCPI-3 1,06 3,23 1,05
CaneCPI-4 2,90 4,38 0,009
Os ensaios foram feitos a 37oC em tampão acetato de sódio 0,1 M , pH 5.5, usando Z-FR-MCA (10 µM) como substrato. ND= não determinado. Os erros nos valores de Ki foram sempre menores que 5%.
5. DISCUSSÃO
Cistatinas são inibidores naturais, competitivos e reversíveis de cisteíno proteases. A função primária das cistatinas é a de regulação das catepsinas
liberadas pelo lisossomo. Diversas catepsinas são expressa em células tumorais e em células associadas a tumor e mostraram grande contribuição para progressão de câncer (Gocheva e Joyce, 2007). Em células tumorais, catepsinas apresentam-se reguladas positivamente, distribuídas em vesículas endossomais e lisossomais, na membrana celular, sendo secretadas e recicladas de volta para a célula. As catepsinas extracelulares são capazes de degradar proteínas de matriz extracelular tais como laminina (Buck et al., 1992; Ishidoh e Kominami, 1995), colágeno tipo IV (Buck et al., 1992), tenascina C (Mai et al., 2002) e proteínas de adesão celular como E-cadherin (Gocheva et al., 2006), contribuindo para desadesão da célula tumoral e invasão.
Neste trabalho, examinamos o efeito de cistatinas recombinantes de cana-de-açúcar no desenvolvimento de tumor in vivo e na migração de células,
invasão e proliferação in vitro. Verificamos que as canacistatinas CaneCPI-2,
CaneCPI-3 e CaneCPI-4 não foram tóxicas para as células melanoma, nem endotelial, em ensaio in vitro. Ao contrário, a CaneCPI-2 estimulou claramente
a proliferação de células HUVEC. Cistatinas com atividade de proliferação celular já foram descritas anteriormente. A cistatina de clara de ovo de galinha e a cistatina C podem promover síntese de DNA e proliferação de células (Sun, 1989; Távera et al., 1992; Taupin et al., 2000) e cistatina C de rato parece
cooperar com o fator de crescimento de fibroblasto básico (bFGF/FGF-2), mostrando atividade mitogênica (Taupin et al., 2000). Muitos autores têm
indicado uma relação aumentada de catepsina em relação às cistatinas em diferentes tumores comparado a tecidos normais (revisado por Cox, 2009).
No presente trabalho, mostramos que a CaneCPI-4 inibiu o brotamento de células endoteliais in vitro cultivadas sobre Matrigel de forma dose
dependente, enquanto que a CaneCPI-2 estimulou a formação de estruturas pró-angiogênicas. Já CaneCPI-3 não parece modular a angiogênese in vitro. O
efeito estimulante da CaneCPI-2 pode envolver a atividade de proliferação dessa cistatina, como descrito acima.
Células endoteliais formam rapidamente estruturas similares a capilares
in vitro quando cultivadas sobre uma matriz extracelular de membrana basal,
como o Matrigel O processo de diferenciação envolve vários passos na formação de vasos sanguíneos, incluindo fusão de célula, migração, alinhamento, secreção de proteases e formação tubular (Arnaoutova et al.,
2009). Para verificar a habilidade das cistatinas da cana-de-açúcar de modular a migração de células endoteliais, usamos o método de wound healing.
CaneCPI-4 (1 µM) impediu completamente a migração de HUVEC, enquanto células incubadas com CaneCPI-2 (1 µM) não mostraram nenhuma diferença significativa quando comparadas às células não tratadas. O efeito da CaneCPI- 4 (1 µM) na migração de células endoteliais foi significativamente mais evidente do que na migração de células de melanoma.
A terapia anti-angiogênica representa uma reconhecida estratégia para o tratamento de câncer (Eichhorn et al., 2007). Para investigar o efeito das
cistatinas da cana-de-açúcar no desenvolvimento tumoral angiogênese- dependente in vivo, células B16F10-Nex2 foram inoculadas subcutaneamente
CaneCPI-2, CaneCPI-3 e CaneCPI-4. A única cistatina capaz de prolongar a sobrevida do camundongo desafiado com células tumorais foi a CaneCPI-4. A CaneCPI-2, como esperado, reduziu significativamente a sobrevida do animal, provavelmente induzindo angiogênese local e aumentando a proliferação de células de melanoma, como observado na análise in vitro. CaneCPI-3, por sua
vez, demonstrou-se inativa neste sistema.
É bem estabelecido que células tumorais são notavelmente heterogêneas. Freitas et al (1994) mostraram que diferentes clones da
linhagem de melanoma B16F10-Nex2 tinham habilidades opostas para colonizar os pulmões de camundongos singênicos e alogênicos desafiados intravenosamente. Estes dois clones mostraram diferentes agressividades quando injetadas subcutaneamente, embora os clones tenham crescido igualmente bem in vitro. Numa população de células tumorais, o fenótipo
metastático é desempenhado por um pequeno número de células tumorais capazes de sobreviver na circulação sanguínea e ficar retidas nas camadas capilares aderindo às células endoteliais e/ou à membrana subendotelial que pode estar exposta (Fidler, 2003). Extravasamento da corrente sanguínea pode envolver mecanismos similares àqueles usados durante invasão.
CaneCPI-2 e CaneCPI-4 foram utilizadas para tratar animais inoculados intravenosamente com células de melanoma B16F10-Nex2, protocolo que mimetiza o processo metastático. Os nossos resultados mostram que ambas as cistatinas inibiram a formação de nódulos pulmonares. Enquanto as catepsinas B e L podem estar envolvidas nos primeiros passos do processo metastático parece que elas desenvolvem um papel pequeno no espalhamento hematogênico de células tumorais (Leto et al., 1994). É possível então que
ambas as cistatinas da cana-de-açúcar, considerando o protocolo de administração utilizado, possam atuar em cisteíno proteases para a implantação e desenvolvimento inicial do tumor metastático.
Proteases têm como alvo de uma grande variedade de substratos os quais inibem ou estimulam a progressão de câncer, tais como fatores de crescimento, receptores de morte celular, cistatina-C, galectina, pró-colágeno, e outras proteases (Flores-Reséndiz et al., 2009). Além disso, proteases
podem clivar moléculas de adesão celular, tal como E-cadherina epitelial, levando a desorganização de junções célula-célula (Masterson e O’Dea, 2007; Gocheva e Joyce, 2007). Estes diferentes mecanismos de invasão modulados por proteases não são mutuamente exclusivos, pois eles agem em conjunto para promover espalhamento de células de câncer (Joyce e Pollard, 2009). A inibição farmacológica ou a remoção genética destas proteases promove uma redução de invasão de células tumorais (Gocheva et al., 2006, Egeblad e
Werb, 2002; Joyce et al., 2004).
Os nossos resultados mostraram que a CaneCPI-2 e a CaneCPI-4 reduziram a metástase pulmonar, agindo como inibidores naturais de cisteíno- protease, e também inibiram a invasão de células tumorais in vitro em Matrigel.
O aparente efeito contraditório da CaneCPI-2, estimulando o crescimento tumoral no modelo subcutâneo e inibindo colonização pulmonar de melanoma no modelo metastático, pode ser entendido comparando a população inicial e a metastática de células tumorais em relação à expressão de cisteíno proteases. Além disso, células tumorais apresentaram aumento de proliferação quando injetadas diretamente no subcutâneo do animal na presença da CaneCPI-2, provavelmente devido à estimulação do processo
angiogênico no local da injeção. Neste caso, a função não-proteolítica da CaneCPI-2 pode contribuir para proliferação celular. Por outro lado, no modelo de colonização pulmonar, o efeito inibidor contra cisteíno proteases, enzimas fundamentais para invasão celular, promoveu a redução dos nódulos pulmonares.
Gianotti et al. (2006) demonstraram que CaneCPI-2, CaneCPI-3, e
CaneCPI-4 possuem diferentes potenciais de inibição quando agindo nas catepsinas recombinantes humanas B e L. Porém, enquanto a CaneCPI-2 e a CaneCPI-3 mostraram uma fraca inibição sobre a catepsina B, com valores de
Ki de 0,47 e 2.44 µM, respectivamente, a CaneCPI-4 inibiu efetivamente a
atividade da enzima, com um Ki muito baixo de 0.83 nM (Gianotti et al., 2006).
No presente trabalho testamos o efeito inibitório das três canacistatinas (CaneCPI-2, CaneCPI-3, e CaneCPI-4) sobre a atividade catalítica das catepsinas K, S e V. Encontramos valores de Ki na ordem de nM para todas as
catepsinas testadas mostrando o forte efeito inibitório destas cistatinas
Os nossos resultados mostram que as cistatinas da cana-de-açúcar são potencias alvos terapêuticos no combate ao câncer. A continuidade do estudo deverá mostrar o papel destas cistatinas na invasão de células cancerígenas concentrando-se nas suas especificidades, nas células tumorais e no microambiente.
6. CONCLUSÕES
Neste estudo, demonstramos a potente atividade inibitória da CaneCPI-4 contra células de melanoma in vitro e in vivo. Novas estratégias de terapia com
foco nos inibidores cisteíno protease são promissoras, com a possível aplicação desta fitocistatina em estratégias anticâncer.
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