CRP (2) nöro-biyosensörünün tekrar üretilebilirliği

Tekrar üretilebilirliğin tanımı, başka herhangi bir analitik cihazda olduğu gibi elektrokimyasal biyosensörler için de aynıdır: bir dizi gözlemde veya bir süre boyunca gerçekleştirilen sonuçlarda saçılma veya kaymanın bir ölçüsüdür. Genellikle lineer aralık içindeki analit konsantrasyonları için belirlenir. ITO temelli, PAMAM ve 11-CUTMS ile dekore edilmiş CRP nöro-biyosensörünün tekrar-üretilebilirlik kabiliyeti, aynı prosedürle farklı zamanlarda hazırlanan 10 biyosensör sisteminin 21-6148 fg / mL tayin aralığındaki cevaplarının izlenmesi ile değerlendirilmiştir. Tekrarüretilebilirlik çalışmaları sonucunda 6 nöro-biyosensörün yanıtlarının CRP için 21-6148 fg mL-1 arasındaki benzer doğrusallığı gösterdiği bulunmuştur (Çizelge 4.6).

Tekrar üretilebilirliğe ait sonuçların lineer eşitliklerine ait eğimlerin ve interseptlerin relatif standart sapmaları sırasıyla %3,39 ve %2,21 olarak bulunmuştur. Tekrarlanabilirlik ve tekrarüretilebilirlik sonuçları, PAMAM ve 11-CUTMS'den oluşan yüzey platformunun, CRP'nin 21-6148 fg / mL konsantrasyon aralığında yüksek duyarlılıkla tanınmasına izin verdiğini göstermektedir.

118

Çizelge 4. 6. CRP Nöro-biyosensörünün tekrar üretilebilirliğine ait doğru denklemleri

Biyosensör numarası y R² Lineer aralık (fg/mL)

Biyosensörün tekrar üretilebilirliği

1 1104,2x + 958,06 0,9819 21-6148

2 1222,5x + 979,24 0,9838 21-6148

3 1369,8x + 864,3 0,9894 21-6148

4 1118,4x + 916,5 0,9832 21-6148

5 1202,5x + 949,3 0,9851 21-6148

6 1056x + 1080,5 0,9894 21-6148

4.2.3.4. CRP nöro-biyosensörünün rejenerasyon kapasitesi (tekrar-kullanılabilirlik)

Geliştirilen nöro-biyosensörün rejenere edilebilme kapasitesi 10 mM HCl rejenerasyon çözeltisi ile muamele edilerek test edilmiştir. Biyosensör sistemlerinde yer alan etkileşimler göz önüne alındığında, potansiyel enerji farklılıkları genellikle biyoreseptör ( anti-CRP) / analit (CRP) bağlanmasında önemli bir güçtür. Etkileşimler, genellikle yük-yük etkileşimleri tarafından aracılık edilir. Belirli bir çözelti pH'sında, , amino asit kalıntısının izoelektrik noktasına (pI) bağlı olarak, yapı pozitif veya negatif olarak yüklenebilir. Yükün çözücü ortamına bağlı olması nedeniyle, çözücü içindeki iyonik kuvvet, pH ve rakip iyonların varlığı gibi faktörler, biyosensör rejenerasyonunda başrol oynayan biyoreseptor ve analit arasındaki entalpik etkileşimleri etkilemektedir. Kulllanılan rejenerasyon çözeltisi ile (HCl), geliştirilen PAMAM-CUTMS platformundan oluşan nöro- biyosensör sistemi 4 kere rejenere edilebilmiş, daha sonra sinyal kritik anlamda kaybedilmiştir (Şekil 4.20). Biyoalgılama platformunun bozulmuş olması, CRP’nin algılanmasına mani olmuştur.

119

Şekil 4. 20. CRP Nöro-biyosensörünün rejenerasyon kapasitesi

Sensör geliştirmede yüksek maliyet esas olarak enstrümantasyon ve materyallerin yüksek maliyetine bağlı olmaktadır. Tekrar kullanılabilir (rejenere edilebilir) sensörlerin varlığı maliyetleri azaltmak için önemli bir yoldur. Ekonomik nedenlerden ayrı olarak, cihazdan cihaza varyansın büyük bir hata kaynağı olabileceği uygulamalarda sensörlerin tekrar kullanılabilirliği (rejenere edilebilirliği) kaçınılmazdır.

4.2.3.5. Sabit frekansta impedans analizi

Anti-CRP antikor - CRP bağlanmasının kinetiksel davranışı sabit frekanslı impedans teknikliği ile değerlendirilmiştir. Bu yöntem, elektriksel yüzeydeki değişikleri anlamak adına oldukça kullanışlıdır. Bu amaçla, potentiostat, Bode plot yardımıyla tanımlanan sabit bir (10 Hz) frekansa ayarlanmıştır. Şekil 4.21 PAMAM-CUTMS modifiyeli nörobiyosensörün BSA adımına ait bir Bode eğrisini göstermektedir.

0,0 0,6 1,2 1,8 2,4 3,0 3,6

1 2 3 4 5

∆ R ct (k Ohm )

Rejenerasyon döngüsü

120 Şekil 4. 21. CRP Nöro-biyosensörünün bode grafiği

Şekil 4. 22. CRP nöro-biyosensörünün sabit frekansta impedans analizi

Bode grafiğinin değerlendirilmesi neticesinde parametreleri belirlenen SFI analizi non faradiyik prosesle ilerlemiştir (Şekil 4.22). CRP’nin anti-CRP’ye olan afinitesi 3200 ks civarında bir doygunluk noktasına erişmektedir. Antikor/antijen ilişkisi non faradiyik süreçte impedanstaki ve faz açısındaki değişimle takip edilmiştir.

Faradayik EIS'de bir redoks türü dönüşümlü olarak oksitlenip-indirgenir. Bu nedenle, faradaik EIS ortamına redoks-aktif türlerin ve DC koşullarının, tüketilmeyecek şekilde eklenmesini gerektirir. Aksine, nonfaradaik impedans spektroskopisi için ek reaktif gerekmemektedir, bu da non-faradayik çalışmalarıı point of care uygulamalarına daha uygun hale getirmektedir. Sabit frekansta non -faradaik bir şemaya dayanan bir biyosensör uygulamaları kapasitif sensörlere dahildir. Bu noktadan değerlendirildiğinde, SFI ile örneklerin analizi umut vaat edicidir.

121 4.2.3.6. Kare dalga voltametrisi

Geliştirilen nöro-biyosensör sisteminin CRP’ye verdiği yanıt başka bir elektrokimyasal teknik olan SWV ile de takip edilmiştir. SWVden elde edilen voltamogram (Şekil 4.23.A) incelendiğinde CRP konsantrasyonu arttıkça tepe akımındaki azalma arasında doğrusal bir ilişki olduğu görülmektedir. Kare dalga voltametrisinden elde edilen kalibrasyon grafiği ile EIS sonuçlarından elde edilen grafik benzer hassasiyet göstermektedir (Şekil 4.23.B).

A

B

Şekil 4. 23. (A) Nöro-biyosensör sisteminin farklı CRP konsantrasyonlarına kare dalga voltametrisi ile verdiği yanıt, (B) kare dalga voltametrisinden elde edilen kalibrasyon grafiği

Son yıllarda, kare dalga voltametrisinin (SWV) kullanımı, hassas elektrokimyasal sensörler ve biyosensörlerin üretilmesinde temel olmuştur. Bir sensörün etkinliği, analitiyle

y = 2,323x + 0,8456 R² = 0,9894 0,0

4,0 8,0 12,0

0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0

Δ Idif (A)

CRP (pg/mL)

122

ilgili olarak ne kadar hassas ve seçici olduğu ile doğru orantılıdır. CRP için geliştirilen nöro biyosensör sisteminde de görüldüğü üzere, bu etkinlik, SWV gibi daha hassas bir elektrokimyasal teknik uygulanarak artırılabilir. SWV gibi puls tekniklerinin arkasındaki temel ilke, yük ve faradaik akımların ayrışma oranlarındaki farktır. Yük akımı, bir üstel fonksiyon olarak ayrışarak faradaik akımdan çok daha hızlı bozulurken, faradayik akımın ayrışması zamanın karekökü ile ters orantılıdır. Bu nedenle, her puls’un sonucu olarak, kapasitif akım faradaik akımınkine kıyasla ihmal edilebilir. Faradayik akımın faradayik olmayan akıma oranının artması, daha yüksek bir saptama sınırının yanı sıra daha düşük bir saptama limitine olanak tanır ve bu nedenle SWV’nin analitik amaçlar için kullanımı oldukça idealdir. SWV bu çalışmada da olduğu gibi yüksek frekansta çalıştırılabilme özelliğinden dolayı da oldukça tercih edilen bir tekniktir. Bu sayede kare dalga kullanılan deneyler hızlı bir şekilde gerçekleştirilebilmekte ve diğer tekniklere kıyasla elektroaktif türler korunabilmektedir. Elektroaktif türlerin kullanımını nispeten azaldığı için de ITO elektrot yüzeyi elektroaktif olmayan ürünlerle daha az engellenmiş olur. SWV'nin bir başka avantajı, arka plan akımına dahil edilen oksijenin indirgenmesinden ötürü, oksijenin analit çözeltisinden çıkarılmasının gerekli olmamasıdır (Gupta ve ark. 2011; Lee ve ark. 2012;

Chen ve Shah 2013).

4.2.3.7. CRP nöro-biyosensörünün seçiciliği

11-CUTMS ve PAMAM ile dekore edilerek tasarlanmış nöro-biyosensörün hedef CRP'ye karşı seçiciliği, nonspesifik insan protein antijenleri, HER-3, haptoglobin, HSP-70 ile olan nonspesifik etkileşimlerinin aynı konsantrasyon aralığında (21-6148 fg/mL) incelenmesi ile belirlenmiştir.

Şekil 4.24, HER-3, haptoglobin ve HSP-70 ün nöro-biyosensöre spesifik olmayan çok küçük bir katkısı olduğunu göstermektedir.

123

Şekil 4. 24. Nöro-biyosensör sisteinin farklı antijenlere karşı seçiciliği

Bununla birlikte sensör sistemi aralarında en yüksek afiniteyi HSP70’e göstermiştir.

Bu durum, HSP70’in CRP’ye olan amino asit kalıntısı benzerliğinden kaynaklanmış olabilir.

Nonspesifik etkileşimlerin toplam Rct yanıtına olan bu ihmal edilebilir katkısı, biyosensörün spesifik hedef CRP'ye karşı iyi bir seçiciliği olduğuna işaret etmektedir.