CRP (1) Nöro-biyosensörünün Analitik Performansı

CRP tayinine yönelik geliştirilen biyosensörün optimum çalışma şartları belirlendikten sonra, nöro-biyosensöre ait bazı analitik karakteristikler aydınlatılmaya çalışılmıştır. Bu özellikler aşağıda başlıklar halinde sıralanmıştır.

3.3.6.1. CRP (1) Nöro-biyosensörünün kalibrasyon grafiği

Tasarlanan biyosensörün analitik özellikleri, optimum koşullar altında farklı konsantrasyonlarda hazırlanan standart CRP çözeltilerinin EIS ölçümleri yardımıyla belirlenmiştir. Biyobelirteç konsantrasyonu ile elektron transfer direnci arasındaki ilişki

“eşdeğer devre modeli” ile belirlenmiştir. (Şekil 3.2)

Şekil 3. 2. Nöro-biyosensör sisteminde kullanılan eşdeğer devre modeli

İmpedimetrik immünosensör çalışmalarında sıklıkla kullanılan bu eşdeğer devre modeli, Warburg elementinin yanı sıra direnç ve kapasitif elemanlardan oluşmaktadır. Rct yük transfer direncidir, Rst sistemin çalışma çözeltisinin direncini gösterir, CPE biyoaktif tabakanın sabit faz elemanını gösterir ve Zw Warburg elementidir. Bu unsurlar arasındaki en dikkat çekici değişim, yük transfer direncine (Rct) aittir. Bu devre, elektron transferinin elektrolitten elektroda doğru olan akışını tanımlamak için uygulanmıştır (Macdonald ve Barsoukov 2005).

Bu bilgiye dayanarak, CRP nöro-biyosensörünün kalibrasyon grafiği aşağıdaki denklem kullanılarak çizilmiştir.

ΔRct = Rct(CRP)- Rct(BSA) (3.1)

53

burada Rct (CRP), anti-CRP ve CRP arasında antikor-antijen bağlanmasından sonra elektron transfer direncinin değeridir. Rct (BSA), BSA ile oluşturulmuş biyosensörün bloklama aşamasının yarım daire çapının değeridir.

Lineerlik (Doğrusallık) ölçülen yanıtın doğruluğunu (farklı analit konsantrasyonları ile bir dizi ölçüm için) düz bir çizgi üzerinde gösteren matematiksel olarak, y = mc olarak temsil edilen göstergedir. Burada c analitin konsantrasyonu, y çıkış sinyalidir ve m, biyosensörün duyarlılığıdır (Bhalla, Jolly ve ark. 2016). Analitin (CRP) ‘nin değişen konsantrasyonlarına bağlı olarak optimize biyosensörün verdiği yanıt kalibrasyon grafiği üzerinde gösterilmiştir.

3.3.6.2. CRP (1) nöro-biyosensörünün tekrarlanabilirlik çalışmaları

Bir biyosensör sistemi için ölçümlerin tekrarlanabilirliği, aynı koşullar altında belli bir konsantrasyon üzerinde yapılan tekrar ölçümlerindeki varyasyon anlamına gelir. Bu, ölçümlerin aynı enstrüman veya yöntemle yapıldığı, insan girişinin gerekli olduğu durumlarda aynı gözlemcinin yer aldığı ve ölçümlerin, temel değerin sabit olarak kabul edilebileceği kısa bir süre boyunca yapıldığı anlamına gelir (Bartlett ve Frost 2008).

Tekrarlanabilirlik çalışmaları, optimum şartlar altında hazırlanmış 20 bağımsız ITO elektrodun aynı konsantrasyondaki CRP çözeltileri (52 fg/mL) ile muamele edilmesi ve akabinde EIS ve CV ölçümlerinin alınıp istatiksel değerlendirilmelerinin yapılmasıyla belirlenmiştir.

3.3.6.3. CRP (1) Nöro-biyosensörünün tekrarüretilebilirlik çalışmaları

Tekrar üretilebilirlik, değişen koşullar altında bir konuda yapılan ölçümlerdeki değişimi ifade eder. Değişen koşullar, kullanılan farklı ölçüm metotları ya da enstrümanlar, farklı gözlemciler ya da değerlendiriciler tarafından yapılan ölçümler tekrar üretilebilirlik çalışmasının içerisinde değerlendirebilir (Bartlett ve Frost 2008).

ITO esaslı CRP biyosensörünün tekrar-üretilebilirliği, aynı prosedürle fakat farklı zamanlarda ve farklı araştırıcılar tarafından hazırlanan 10 biyosensör sisteminin belirli CRP tayin aralığındaki cevaplarının izlenmesi ile değerlendirilmiştir.

54

3.3.6.4. CRP (1) nöro-biyosensörünün rejenerasyon çalışmaları (tekrar kullanılabilirlik) Bir biyosensör için analitik açıdan bir diğer önemli parametre sistemin rejenerasyona verdiği yanıt bir diğer değişle tekrar-kullanılabilirliğinin derecesidir. Tekrar-kullanılabilirlik biyosensörün maliyetine ciddi katkılar sağlayan analitik parametrelerden biridir. Rejenerasyon için farklı teknikler ve reaktifler kullanılabilmektedir. Her durumda, biyoreseptör ve analit arasındaki çekici kuvvetlerin üstesinden gelinmek suretiyle rejenerasyon sağlanır (Goode ve ark. 2014).

Geliştirilen nöro-biyosensörün rejenerasyonu, CRP antikor-antijen immüno-kompleksini ayrıştırmak için, CPTMS ile modifiye edilmiş ITO elektrotların 5 dakika boyunca 10 mM HCl içine daldırılmasıyla gerçekleştirilmiştir. Elektrotlar daha sonrasında ultra saf suyla iyice yıkanıp, argon gazı altında nazikçe kurutulmuştur. İmmunokompleksin ayrışması EIS ile takip edilmiştir. Yüzeyden antijeni iyonik kuvvet yoluyla kopartılmış olan elektrotlar CRP’nin aynı konsantrasyonuyla (52 fg/mL) tekrar muamele edilmiş ve akabinde EIS ölçümü alınmıştır. Tekrar eden bu proses süresince yüzeyin tamamen denatüre olduğu ve biyosensörün çalışma aktivitesini kritik anlamda kaybettiği nokta belirlene dek, biyosensörün rejenerasyon çözeltisiyle muamele edilmesine devam edilmiştir.

3.3.6.5. Sabit Frekansta impedans (SFI) analizi

Antikor / antijen bağlanmasının kinetik davranışının izlenmesi için etkili elektrokimyasal yöntemlerden biri sabit frekanslı impedans analizidir.

Bu amaçla, potansiyostat, Bode eğrilerinin yardımıyla tanımlanan sabit bir frekansa (45 Hz) ayarlanmıştır. Üçlü elektrot sistemi non-faradaik prosedürle; CRP içeren 50 mM pH 7,0 fosfat tamponu içerisine daldırılmış ve belirlenen frekansta impedimetrik ölçüm alınmıştır. Zamana bağlı olarak impedimetrik değerde ve faz açısında meydana gelen değişim, antikor-antijen bağlanmasının kinetiksel değerlendirilmesinde kullanılmıştır.

55 3.3.6.6. Kare dalga voltametrisi

Geliştirilen nöro-biyosensörün karakterizasyon aşamaları sadece EIS ve CV teknikleri ile değil, aynı zamvea EIS gibi bir frekansa bağlı olarak başka bir elektrokimyasal teknik olan SWV tarafından da izlenmiştir.

SWV, katodik PULS ve aynı genlikte anodik puls arasındaki bir dizi potansiyel sinyalin birleşiminden oluşmaktadır.

Bu amaçla, optimal koşullarda hazırlanan CPTMS temelli biyosensör, lineer aralıkta hazırlanan farklı CRP konsantrasyonlarıyla muamele edilmiştir. İnkübasyon neticesinde elektrotlar yıkanıp kurutulmuş akabinde ferri-ferro redoks probu içerisinde kare dalga voltametrisiyle ölçümlenmiştir.

3.3.6.7. CRP (1) nöro-biyosensörünün seçicilik çalışmaları

Seçicilik, bir biyo-reseptörün, diğer katkı maddelerini ve kirletici maddeleri içeren bir örnekte spesifik bir analit tespit etme kabiliyetidir. Seçiciliğin en iyi örneği, bir antijenin antikorla etkileşimi ile tasvir edilir.

CRP tayinine yönelik geliştirilen biyosensör sisteminin seçiciliği, non spesifik etkileşimlere ΔRct değerlerindeki değişimlerin takip edilmesiyle belirlenmiştir. Aynı konsantrasyon aralığında hazırlanan; HER-3, haptoglobin, HSP-70 proteinleriyle CPTMS modifiyeli ITO elektrotlar muamele edilmiş ve biyoreseptörün bu proteinlere olan afinitesi değerlendirilmiştir.

3.3.6.8. CRP (1) nöro-biyosensörünün depo ömrü

Geliştirilen CPTMS modifiyeli- ITO tabanlı tek kullanımlık biyosensörün depo ömrü belirli zamanların sonunda immünosensörün impedimetrik tepkisinin izlenmesi ile belirlenmiştir. Optimal koşullar altında hazırlanan nöro-biyosensörler +4°C'de muhafaza edilmiş ve 7 günlük periyotta sabit konsantrasyonda (52 fg/mL) CRP ölçümü EIS ile yapılmıştır. İlk gün edilen değer temel alınarak, biyosensörün aktivitesindeki zaman içerisindeki kayıp grafiksel olarak gösterilmiştir.

56

3.3.6.9. CRP (1) nöro-biyosensörünün klinik örneklerde uygulanabilirliğinin araştırılması

Geliştirilen biyosensör, farklı konsantrasyonlarda CRP içeren sekiz insan serum örneğinde CRP'nin saptanması için kullanılmıştır. Serum örnekleri Namık Kemal Üniversitesi Tıp Fakültesi'nden 2013/86/07/05 araştırma etik kurul onayı ile rastgele seçilerek alınmıştır.

Biyosensörden elde edilen sonuçlar, referans bir teknikle hastanede belirlenen serum CRP seviyeleri ile karşılaştırılmıştır. Namık Kemal Üniversitesi Araştırma hastanesinde CRP ölçümleri, immünoturbidimetrik yöntem kullanılarak Roche Diagnostics model no: cobas c 501 otoanalizörü ile gerçekleştirilmektedir. Serum numunelerinin CRP ölçümleri belirtilen referans yöntemle hastanede gerçekleştirildikten sonra serumlar, zaman kaybetmeden araştırma laboratuarımıza getirilmiştir. Serumlar ölçümler gerçekleştirilene dek belirli porsiyonlar halinde -20^o C’de muhafaza edilmiştir. Sağlıklı kişilerden alınan serum CRP içeriği, geliştirilen biyosensörün tayin aralığından daha yüksek konsantrasyona sahip olduğundan ötürü, serum numuneleri 10⁷ kez seyreltilmiştir.

3.3.6.10. Taramalı elektron mikroskobu (SEM)

Namık Kemal Üniversitesi (NABİLTEM) Bilimsel ve Teknolojik Araştırma Merkezi'nde biyosensör üretim prosesinin her bir adımına, alan emisyon taramalı elektron mikroskobu (FEI-Quanta FEG 250) işlemi uygulanarak farklı yüzeylerin morfolojik olarak incelenmesi sağlanmıştır. SEM görüntülerini elde etmek için 5 kV bir hızlanma gerilimi kullanılmıştır.

3.3.6.11. Fourier-dönüşümlü kızılötesi spektroskopi (FTIR)

Biyosensör geliştirilirken yüzeyde oluşan bağların doğasını araştırmak amacıyla Namık Kemal Üniversitesi (NABİLTEM) Bilimsel ve Teknolojik Araştırma Merkezi'nde 4000–400 cm⁻¹ aralığında işletilen Fourier-dönüşümlü kızılötesi spektroskopi (FTIR) spektrumları kaydedilmiştir.

57