CRP (2) nöro-biyosensörünün analitik performansı

CRP tayinine yönelik geliştirilen biyosensörün optimum çalışma şartları belirlendikten sonra, nöro-biyosensöre ait bazı analitik karakteristikler aydınlatılmaya çalışılmıştır. Bu özellikler aşağıda başlıklar halinde sıralanmıştır.

3.4.6.1. CRP (2) nöro-biyosensörünün kalibrasyon grafiği

Tasarlanan biyosensörün analitik özellikleri, optimum koşullar altında farklı konsantrasyonlarda hazırlanan standart CRP çözeltilerinin EIS ölçümleri yardımıyla belirlenmiştir. Biyobelirteç konsantrasyonu ile elektron transfer direnci arasındaki ilişki

“eşdeğer devre modeli” ile belirlenmiştir. (Şekil 3.4)

Şekil 3. 4. Nöro-biyosensör sisteminde kullanılan eşdeğer devre modeli

İmpedimetrik immünosensör çalışmalarında sıklıkla kullanılan bu eşdeğer devre modeli, Warburg elementinin yanı sıra direnç ve kapasitif elemanlardan oluşmaktadır. Rct yük transfer direncidir, Rst sistemin çalışma çözeltisinin direncini gösterir, CPE biyoaktif tabakanın sabit faz elemanını gösterir ve Zw Warburg elementidir. Bu unsurlar arasındaki en dikkat çekici değişim, yük transfer direncine (Rct) aittir. Bu devre, elektron transferinin elektrolitten elektroda doğru olan akışını tanımlamak için uygulanmıştır (Macdonald ve Barsoukov 2005).

Bu bilgiye dayanarak, CRP nöro-biyosensörünün kalibrasyon grafiği aşağıdaki denklem kullanılarak çizilmiştir.

ΔRct = Rct(CRP)- Rct(BSA) (3.2)

61

burada Rct (CRP), anti-CRP ve CRP arasında antikor-antijen bağlanmasından sonra elektron transfer direncinin değeridir. Rct (BSA), BSA ile oluşturulmuş biyosensörün bloklama aşamasının yarım daire çapının değeridir.

Lineerlik (Doğrusallık) ölçülen yanıtın doğruluğunu (farklı analit konsantrasyonları ile bir dizi ölçüm için) düz bir çizgi üzerinde gösteren matematiksel olarak, y = mc olarak temsil edilen göstergedir. Burada c analitin konsantrasyonu, y çıkış sinyalidir ve m, biyosensörün duyarlılığıdır (Bhalla, Jolly ve ark. 2016). Analitin (CRP) ‘nin değişen konsantrasyonlarına bağlı olarak optimize biyosensörün verdiği yanıt kalibrasyon grafiği üzerinde gösterilmiştir.

3.4.6.2. CRP (2) nöro-biyosensörünün tekrarlanabilirlik çalışmaları

CRP tayinine yönelik geliştirilen biyosensörün tekrarlanabilirlik performansı optimum şartlar altında hazırlanan 18 bağımsız ITO elektrodun aynı CRP konsantrasyonu (1,7 pg/mL) ile muamele edilmesiyle ve akabinde EIS ve CV verilerinin istatiksel açıdan değerlendirilmesiyle belirlenmiştir.

3.4.6.3 CRP (2) nöro-biyosensörünün tekrar-üretilebilirlik çalışmaları

ITO esaslı CRP biyosensörünün tekrar-üretilebilirliği, aynı prosedürle fakat farklı zamanlarda hazırlanan 10 biyosensör sisteminin belirli CRP tayin aralığındaki cevaplarının izlenmesi ile değerlendirilmiştir.

3.4.6.4. CRP nöro-biyosensörünün rejenerasyon çalışmaları (Tekrar kullanılabilirlik) Geliştirilen nöro-biyosensörün rejenerasyonu, CRP antikor-antijen immüno-kompleksini ayrıştırmak için, CUTMS ile modifiye edilmiş ITO elektrotların 5 dakika boyunca 10 mM HCl içine daldırılmasıyla gerçekleştirilmiştir. Elektrotlar daha sonrasında ultra saf suyla iyice yıkanıp, argon gazı altında nazikçe kurutulmuştur. İmmunokompleksin ayrışması EIS ile takip edilmiştir. Yüzeyden antijeni iyonik kuvvet yoluyla kopartılmış olan elektrotlar CRP aynı konsantrasyonuyla (1,7 pg/mL) tekrar muamele edilmiş ve akabinde EIS ölçümü alınmıştır. Tekrar eden bu proses süresince yüzeyin tamamen denatüre olduğu ve

62

biyosensörün çalışma aktivitesini kritik anlamda kaybettiği nokta belirlene dek, biyosensörün rejenerasyon çözeltisiyle muamele edilmesine devam edilmiştir.

3.4.6.5. Sabit frekansta impedans (SFI) analizi

Antikor / antijen bağlanmasının kinetik davranışının izlenmesi için etkili elektrokimyasal yöntemlerden biri sabit frekanslı impedans analizidir.

Bu amaçla, potansiyostat, Bode eğrilerinin yardımıyla tanımlanan sabit bir frekansa (10 Hz) ayarlanmıştır. Üçlü elektrot sistemi non-faradaik prosedürle; CRP içeren 50 mM pH 7.0 fosfat tamponu içerisine daldırılmış ve belirlenen frekansta impedimetrik ölçüm alınmıştır. Zamana bağlı olarak impedimetrik değerde ve faz açısında meydana gelen değişim, antikor-antijen bağlanmasının kinetiksel değerlendirilmesinde kullanılmıştır.

3.4.6.6. Kare dalga voltametrisi

Geliştirilen nöro-biyosensörün karakterizasyon aşamaları sadece EIS ve CV teknikleri ile değil, aynı zamanda EIS gibi bir frekansa bağlı olarak başka bir elektrokimyasal teknik olan SWV tarafından da izlenmiştir. 11-CUTMS ve PAMAM ile dekore edilmiş elektrotların belirli tayin aralığındaki CRP ölçümleri başlık 3.3.6.6 anlatıldığı prensible gerçekleştirilmiştir.

3.4.6.7. CRP (2) nöro-biyosensörünün seçicilik çalışmaları

CRP tayinine yönelik geliştirilen 11-CUTMS/PAMAM modifiyeli nöro-biyosensörün başka proteinlere karşı oluşabilecek afinitesi başlık 3.3.6.7. ‘de anlatılan teknikle araştırılmıştır. Seçicilik araştırması yapılırken kullanılan proteinler; HSP70, haptoglobin, HER-3’dür.

3.4.6.8. CRP (2) nöro-biyosensörünün depo ömrü

Geliştirilen 11-CUTMS/PAMAM modifiyeli- ITO tabanlı tek kullanımlık biyosensörün depo ömrü belirli zamanların sonunda immünosensörün impedimetrik tepkisinin izlenmesi ile belirlenmiştir. Optimal koşullar altında hazırlanan nöro-biyosensörler +4°C'de muhafaza edilmiş ve 7 günlük periyotta sabit konsantrasyonda CRP’nin (1,7 pg/mL) EIS ile

63

ölçümlenmesiyle gerçekleştirilmiştir. İlk gün edilen değer temel alınarak, biyosensörün aktivitesindeki zaman içerisindeki kayıp grafiksel olarak gösterilmiştir.

3.4.6.9. CRP (2) nöro-biyosensörünün klinik örneklerde uygulanabilirliğinin araştırılması

Geliştirilen 11-CUTMS/PAMAM modiyeli biyosensör sisteminin gerçek örneklerde uygulanabilirliği başlık 3.3.6.9’da anlatıldığı şekliyle gerçekleştirilmiştir. Serumlar ölçümler gerçekleştirilene dek belirli porsiyonlar halinde -20^o C’de muhafaza edilmiştir. Sağlıklı bir kişiden alınan serum CRP içeriği, geliştirilen biyosensörün tayin aralığından daha yüksek konsantrasyona sahip olduğundan ötürü, serum numuneleri 10⁶ kat seyreltilmiştir.

3.4.6.10. Taramalı Elektron mikroskobu (SEM)

Biyosensör geliştirilirken yüzey morfolojisinde meydana gelen değişiklikler başlık 3.3.6.10’da anlatıldığı gibi SEM ile takip edilmiştir.

3.4.6.11. Fourier-dönüşümlü kızılötesi spektroskopi (FTIR)

Biyosensör geliştirilirken oluşan bağlar FTIR ile başlık 3.3.6.11’de anlatıldığı gibi değerlendirilmiştir.

3.5. Synuclein alfa nöro-biyosensörünün Dizaynı ve Fabrikasyonu