Biyokimyasal İşlem ve Ölçümler

Daha önceden alınmış olan ve -80 °C’de tutulan dokular dondurucudan çıkarılarak çözünmesine izin verilmeden hızla hassas terazide tartıldı ve 20 numara bistüri ucu (Braun®) kullanılarak 100 mg olacak şekilde hazırlandı. Buz üzerinde fosfat tampon ile (1/10:w/v) homojenize edildi. 2000xg de 10 dakika santrifüj (Hettich Universal 16R ) edildikten sonra analizler yapıldı. Dokuların analizinde aşağıdaki materyaller kullanıldı.

• Mikroplak okuyucu: Thermo Labsystems Multiskan EX • Santrifüj: Hettich Universal 16R

• pH metre: Radiometer Copenhagen pHM 63 • Su banyosu: Kotterman

• Elektronik terazi: Scaltec SBC-31 • Hassas terazi: Mettler H 20 • Manyetik karıştırıcı: Klees

• Vortex: MS1 Minishaker IKA

3.8.2 Tiyobarbitürik Asitle Reaksiyona Giren Maddelerin (TBARS) Ölçümü

Lipit peoksidayonunun belirlenmesi için MDA ölçümü sık kullanılan bir yöntemdir. MDA ölçümü yaygın olarak TBA ile yapılır. Birçok deneysel çalışmada TBA ölçümünün direk MDA düzeylerini ölçtüğü gösterilmiştir. Ancak bu test MDA’e spesifik olmadığı için birçok sistemde TBARS olarak adlandırılmaktadır. TBA ile MDA’den başka okside lipitler, sialik asit ve aldehit bileşikleri reaksiyona girmektedir. Ancak saf lipitler ile yapılan çalışmalarda TBARS

ölçümünün lipit peroksidasyonu ile iyi birkorelasyon gösterdiği saptanmıştır. Bu nedenle

TBARS ölçümü yaygın olarak lipit peroksidasyon göstergesi olarak kullanılmaktadır [112- 114].

Homojenat üzerine TBA eklendikten sonra 100°C’de 20 dk kaynatılarak 2000 rpm 10 dakika santrifüj edildikten sonra süpernatantta 532 nm dalga boyunda kolorimetrik ölçüm yapıldı. 1,1,4,4 ile hazırlanan standart grafikten nmol/mg MDA hesaplandı, sonuçlar nmol/g Hb olarak verildi.

TBARS ölçümünde kullanılan madde ve reaktifler: TBA

%37 HCl

Triklorasetik asit %100

Standard (1.1.1.3 tetraetoksipropan): 10mM stok standard:22mg TEP 10ml distile suda çözüldü. 10nmol/ml çalışma standardı: 10mM stok standarttan 100μl alındı ve 100ml'ye distile su ile tamamlandı.

3.8.3 Süperoksit Dismutaz (SOD) Ölçümü

Homojenatlar fosfat tampon ile 1/10 dilüe edilerek pH:10.2’de epinefrinin adrenokroma otooksidasyonu temeline dayalı kolorimetrik yöntem ile SOD düzeyleri hesaplandı.

2 mL karbonat tampon üzerine örnek ve %0.55 epinefrin çözeltisinden eklenerek absorbans artışı 15 saniye ara ile 3 dakika boyunca 480 nm dalga boyunda izlendi. Enzimin epinefrinin adrenokroma otooksidasyonunu inhibe etme yüzdesi hesaplandıktan sonra standart grafikten elde edilen veriler U/gr Hb olarak değerlendirildi.

SOD ölçümünde kullanılan madde ve reaktifler: Epinefrin %0.55 Karbonat tampon (pH:10.2) HCl %37 Standart (SOD) 3.8.4 Katalaz (KAT) ölçümü

Homojenatlar fosfat tampon ile 1/10 dilüe edilerek hidrojen peroksitin katalaz tarafından parçalanması temeline dayalı UV spektrofotometrik yöntem ile düzeyleri tayin edildi.

Taze hazırlanan 30 mM H2O2 içeren fosfat tampon çözeltisi üzerine örnek eklenerek 240

nm Dalga boyunda absorbansın azalması 15 saniye ara ile 2 dakika boyunca okundu ve lineer regresyonlara göre her bir analiz için en uygun absorbanslar bulunarak, k değeri ve enzim miktarı hesaplandı.

Sonuçları standardize etmek için; veriler U/gr Hb enzim aktivitesi olarak verildi. Katalaz aktivitesini ölçmede kullanılan madde ve reaktifler:

Hidrojen peroksit (%30) Fosfat tampon 50mM (pH:7.0) 3.8.5 Myeloperoksidaz (MPO) ölçümü

MPO aktivitesinin ölçümü için Rat Myeloperoxidase ELISA Kit (MyBiosource firması, katalog no: MBS046496) kullanıldı.

Bu ELISA kiti yöntem olarak Sandwich-ELISA kullanmaktadır. Bu kit ile verilen Microelisa pleyti, MPO Standartlarına özgü spesifik bir antikor ile önceden kaplanmıştır. Numuneler, uygun Microelisa şerit plakalarına eklenerek içeriğindeki spesifik antikorla birleştirilir. Daha sonra, her Microelisa şerit kuyusuna, MPO ölçümü için spesifik bir Horseradish Peroxidase (HRP) konjuge antikor eklenerek inkübe edilir. Yıkama işleminin ardından TMB substrat çözeltisi her kuyucuğa eklenir. Yalnızca MPO ve HRP ile konjuge ettiğiniz, MPO antikoru içeren bu kuyular; mavi renkte görünecek ve ardından durdurma

solüsyonu ilave edildikten sonra sarıya dönecektir. Optik yoğunluk (OD) 450 nm dalga boyunda spektrofotometrik olarak ölçülür. OD değeri MPO konsantrasyonu ile orantılıdır. Örnekteki MPO seviyesi standart eğrindeki absorbans değerlerine göre hesaplanır.

3.8.6 Poli ADP riboz polimeraz (PARP) ölçümü

İskemi reperfüzyon hasarı sonucunda DNA’da oluşan zincir kırıklarının tamir mekanizmasında PARP enzimi rol almaktadır. Bu nedenle DNA hasarı varlığında PARP enzim aktivitesi artmaktadır.

PARP çekirdekte geniş dağılım alanına sahip 113 kDa ağırlığında bir proteindir. NAD+ (β-nikotinamid adenin dinükleotit)’ı substrat olarak kullanıp 200 veya daha üzeri Poli (ADP-

riboz) birimleri sentezleyebilir [115].

PARP aktivitesinin ölçümü için Rat PARP ELISA kiti (SunRed firması, katalog no: 201-11-0224) kullanıldı.

ELISA (enzim bağlantılı immünosorbent assay) kiti PARP içeren biyolojik araştırma örneklerinde teorik bir kit algılama aralığı oluşturur. Bunu biyokimyasal teknikle PARP antikor- PARP antijen etkileşimlerine (immünosorbens) ve numunelerde PARP antijen hedeflerini saptamak için bir HRP kolorimetrik tespit sistemi sayesinde yapmaktadır. ELISA Kiti, doğal olan, rekombinant olmayan PARP’ı tespit etmek için tasarlanmıştır.

3.8.7 Kas Dokusunda Yirmidördüncü Saatteki İnflamasyonun Belirlenmesi

24. saatte alınan kas dokusu örnekleri bir gün süreyle %10’luk formaldehit solüsyonunda fikse edildi. Rutin parafin gömme prosedürü uygulanarak bloklanan dokulardan hematoksilen eozin inceleme için 5 µm kalınlıkta kesitler alındı. Hematoksilen eozin boyalı lamlar ışık mikroskobunda (Olympus BX-51) değerlendirilerek; bir büyük büyütme alanındaki (X400) nötrofil lökosit sayısı; 0= <3 inflamatuar hücre, 1= 3-10 inflamatuar hücre, 2= 11-20 inflamatuar hücre, 3=21-30 inflamatuar hücre, 4=31-40 inflamatuar hücre, 5= ≥41 inflamatuar hücre şeklinde skorlandı.

3.8.8 Kas Dokusunda Bir Hafta Sonrasında Oluşan Kronik İnflamasyonun Değerlendirilmesi

Birinci haftanın sonunda alınan tibialis anterior kas dokusu örnekleri bir gün süreyle %10’luk formaldehit solüsyonunda fikse edildi. Rutin parafin gömme prosedürü uygulanarak bloklanan dokulardan hematoksilen eozin inceleme için 5 µm kalınlıkta kesitler alındı.

Hematoksilen eozin boyalı lamlar ışık mikroskobunda (Olympus BX-51) değerlendirilerek; bir büyük büyütme alanındaki (X400) mononükleer hücre sayısı; 0= <3 inflamatuar hücre, 1= 3- 10 inflamatuar hücre, 2= 11-20 inflamatuar hücre, 3=21-30 inflamatuar hücre, 4=31-40 inflamatuar hücre, 5= ≥41 inflamatuar hücre şeklinde skorlandı.

3.8.9 Kas Dokusunda iNOS Pozitifliğinin Değerlendirilmesi

Birinci haftanın sonunda gönderilen tibialis anterior kas dokusu örnekleri bir gün süreyle %10’luk formaldehit solüsyonunda fikse edildi. Rutin parafin gömme prosedürü uygulanarak bloklanan dokulardan immunohistokimyasal inceleme için polilizinli lamlara 5

µm kalınlıkta kesitler alındı. Alınan kesitler deparafinizasyon işlemleri sonrası, universal kit kullanılarak otomatik boyama sistemi (Dako autostainer 48 link cihazı) ile iNOS monoklonal antikoru (Clone SP126, Springbio) uygulandı. Işık mikroskopik değerlendirmede dokuda iNOS yoğunluğu 0= negatif, 1= hafif, 2= orta ve 3= şiddetli şeklinde derecelendirildi.