6.1 – Caracterização das AgNPs
6.1.1 - Espectroscopia no ultravioleta visível (UV-Vis)
O espectro de UV-Vis das AgNPs está apresentado na Figura 12.
Figura 12– Espectro de UV-vis das AgNPs obtida pela rota de TURKEVICH.
Este espectro mostra um ombro perto de 420 nm, indicando que a amostra analisada possui o comportamento característico de nanopartículas de prata, conforme demonstrado por WANG et al. (2008). De acordo com esses autores, o comprimento de onda característico da absorção das AgNPs ocorre em torno de 400 nm e a posição da banda de absorção está diretamente relacionada ao tamanho médio das partículas, sendo menor quanto menor o comprimento de onda do máximo de absorção. Assim, partículas maiores levam ao deslocamento da banda de absorção para comprimentos de onda maiores e quando o deslocamento é para comprimentos de onda menores, partículas de menor dimensão são formadas. Além disso, o formato das nanopartículas também depende da posição da banda de absorção, sendo mais circular, quanto mais próximo de
400 nm for o seu máximo de absorção. Os espectros com bandas de absorção largas, como o mostrado na Figura 12, mostraram a obtenção de uma amostra com grande dispersão de forma e tamanho.
6.1.2 – Espalhamento dinâmico de luz (DLS)
O tamanho médio das AgNPs determinado por DLS foi de 170,5 nm e índice de polidispersão de 0,295 (Apêndice A). As populações das AgNPs foram localizadas em 160,6 nm (com intensidade fixada em 72% de volume) e 180,3 nm (volume de 73,2% de intensidade). A faixa de variação de tamanho foi de 9-14 nm a 1100-1120 nm, indicando uma ampla faixa de variação do tamanho das nanopartículas, conforme previamente sugerido pelo formato da banda de absorção na região do UV-vis.
Esta ampla faixa de tamanho, como também a dispersão das populações obtidas, é em virtude do agente redutor utilizado, citrato de sódio, onde resultados similares foram obtidos por ZEENA et al. (2004) no estudo da influência do agente redutor no tamanho e na dispersão das nanopartículas obtidas.
6.1.3 - Teste de difusão em ágar das nanopartículas sintetizadas
De acordo com os resultados obtidos (Figura 13), as AgNP resultantes da síntese de Turkevich apresentaram atividade antimicrobiana contra os 2 microrganismos estudados, S. aureus e E. coli. Houve formação de halo de inibição com o valor médio de 1,534 mm para o S. aureus e 2,739 mm para E. coli, tendo a E.coli apresentando um halo mais nítido. Logo, sua ação bactericida foi maior contra o microrganismo E. coli (Gram- negativa), pelo fato de sua membrana plasmática possuir maior número de elétrons livres que a do S. aureus (Gram-positiva). Independentemente, pode-se demonstrar a eficácia das AgNPs contra as modalidades de bactérias: Gram-positivas e Gram-negativa, como também uma difusão das nanopartículas para o meio coloidal/sólido.
Esse resultado indica também que há difusão da prata para o meio de cultura e logo, a importância de quantificar o teor de prata difundido para simulantes de alimentos nas condições de uso.
.
6.1.4 - Teste de toxidade com náuplios de Artemia salina
O ensaio de toxicidade das AgNPs frente ao modelo animal Artemia salina não revelou a DL50 ou CL50 (dose letal ou concentração letal mínima de 50%) para qualquer das amostras testadas, mesmo nas concentrações de 1000 µg/mL. Em todos os tubos que continham concentrações equivalentes a 1000 µg/mL, 100 µg/mL, 10 µg/mL, 1 µg/mL e 0,1 µg/mL de AgNPs não foram observados náuplios de Artemia salina mortos. Logo, esse ensaio mostrou que as AgNPs testadas são atóxicas quanto ao efeito sobre o meio.
Tabela 3 - Resultados da toxidade para Artemia salina nas concentrações propostas.
Amostra C1 C2 C3 C4 C5 TURKEVICH 1000 µg/mL 100 µg/mL 10 µg/mL 1 µg/mL 0,1 µg/mL 0% 0% 0% 0% 0% . .
Este ensaio biológico, usado para avaliar a toxicidade aguda, é considerado um ensaio preliminar no estudo de compostos com potenciais atividades biológicas. Em geral, esses invertebrados são muito utilizados em experimentos de ecotoxicologia ou como alternativa ao teste de irritação em coelhos.
6.2 – Caracterizações do revestimento de PDMS
6.2.1 – Determinação da espessura por microscopia eletrônica de varredura (MEV) As micrografias obtidas para as diferentes condições de aplicação do revestimento de silicone por SBSp estão apresentadas na Figura 14.
Figura 14– Micrografia dos revestimentos de silicone WD20RPM250 (a-b), WD25RMP500 (c-d) e
WD20RPM1000 (e-h) aplicado sobre a lâmina de vidro por SBSp com diferentes magnificações.
A partir da Figura 14a e 14b é possível constatar a formação do revestimento, com distribuição não uniforme e apresentando espessura superior à proposta para o
desenvolvimento deste trabalho ,1~3 µm (CHOONEE et al., 2009; TAVARES et al., 2014). Logo a condição WD20RPM250 foi considerada insatisfatória para este trabalho.
Apesar da redução significativa da espessura com o aumento da distância de trabalho e rotação do coletor, a condição WD25RPM500 (Figura 14c e 14d) não atingiu o
resultado desejado, pois a espessura média do revestimento ficou em torno de 12,51 µm. Apenas uma melhora na sua uniformidade foi observada.
Por último, tem-se que o aumento da rotação do coletor para 1000 rpm mantendo a distância de trabalho em 20 cm reduziu a espessura do revestimento para aproximadamente (1,42 ± 0,2) µm, alcançando assim a espessura desejada (Figura 14e-h). Além disso, tem-se que a espessura do revestimento mostrou-se uniforme ao longo de todas as seções transversais analisadas. Logo, esta condição foi definida como ideal para o desenvolvimento deste trabalho e foi utilizada para aplicação do silicone sobre o substrato de vidro.
Esse estudo preliminar também permitiu concluir que a distância de trabalho e a rotação do coletor foram variáveis determinantes do SBSp para a obtenção de filmes finos de PDMS. A primeira variável está relacionada com o alcance do leque da solução aspergida pelo bico de aplicação e o segundo fator está relacionado com a uniformidade e redução da espessura do revestimento através de utilização de força centrifuga.
6.2.2 – Determinação do tempo de cura por calorimetria exploratória diferencial (DSC) A curva de cura do PDMS está apresentada na Figura 15. O pico exotérmico indicado com dois asteriscos (**) é resultado de uma liberação rápida de calor, referente à combustão de gás hidrogênio e produtos inflamáveis proveniente do agente de cura (CORNING, 2013). O restante da curva, a partir do ponto 2 (dois) apresenta-se no formato característico de um processo de cura padrão.
Figura 15– Isoterma de cura do PDMS
A partir desse perfil de cura (Figura 15), os tempos para aplicação das AgNPs foram estimados subdividindo-o em 4 intervalos iguais. Assim, foi considerado que o processo de cura do PDMS iniciou após 40 minutos do início do aquecimento do PDMS e terminou após 70 minutos, tendo, portanto, uma duração de 30 minutos. Esse tempo foi subdividido em 4 intervalos iguais, que corresponde a intervalos de 7 minutos e 30 segundos, cada. Assim, os intervalos de tempo estabelecidos para aplicação das AgNPs sobre o revestimento de PDMS foram: t0= 40 min; t¼ = 47,5 min; t½ = 55 min;
6.3 – Caraterizações dos revestimentos de PDMS/AgNPs
6.3.1 - Microscopia eletrônica de varredura acoplada a espectrometria de energia dispersiva de raios-X (MEV/EDS)
As micrografias de MEV e o mapeamento da prata dos revestimentos obtidos por aplicação única em diferentes tempos e por aplicações múltiplas estão apresentados nas
Figuras 16 e 17, respectivamente.
Através das micrografias da superfície das amostras, pode-se observar um aumento significativo de pontos de aglomeração de AgNPs, pontos mais claros, com o aumento do tempo para início da aplicação das AgNPs, ou seja, com a aplicação das AgNPs sobre o revestimento de PDMS com maior grau de cura (Figura 16). Essas aglomerações ficaram ainda mais nítidas para o revestimento de PDMS preparado por aplicações múltiplas.
Este comportamento é justificado pelo aumento da viscosidade do silicone com o decorrer do tempo de cura que acabou favorecendo o ancoramento das AgNPs sobre sua superfície.
A partir dos mapas composicionais da prata nos revestimentos, pode-se observar a presença das nanopartículas de prata, identificada pelos pontos brancos, em todas as condições propostas e sua disposição de forma geral uniforme em todas as amostras. Conforme esperado, foi também possível perceber uma maior concentração de prata na amostra tmulti. No caso das amostras preparadas pelo método de aplicação única, a
presença de prata aumentou nas amostras preparadas em tempos de cura iguais ou maiores à metade do tempo total de cura do PDMS, indicando um melhor ancoramento das nanopartículas na superfície do revestimento nessas condições. Para as amostras t0 e t¼, o
ancoramento das AgNPs na superfície ficou comprometido, indicando que o grau de cura do PDMS é insuficiente para promover a adesão das nanopartículas no revestimento (Figura 17).
6.3.2 - Espectrometria de Emissão Atômica com Plasma Acoplado Indutivamente (ICP- AES)
Para as amostras preparadas pelo método de aplicação única foram obtidos valores de teor de prata abaixo de 0,0311 µg/cm2, limite de detecção do método analítico. Para a
amostra tmulti, foi obtido um valor médio de 0,0471 µg/cm2de teor de prata por unidade
de área de filme aplicado no substrato utilizado. Para a amostra de PDMS puro não foi detectado a presença de prata no revestimento, conforme exposto pela Tabela 4.
Tabela 4 - Teor de prata nos revestimentos Amostras Teor de Prata (µg/cm2)
PDMS n.d 1 t0 < 0,0311 t1/4 < 0,0311 t1/2 < 0,0311 t3/4 < 0,0311 tf < 0,0311 tmulti 0,0471 ± 0,0004 2
1 n.d. – não detectado; 2 Valores da média e desvio padrão da triplicata.
Como esperado, as múltiplas aplicações de AgNPs sobre o revestimento de PDMS produziu um revestimento com maior teor de prata que aqueles preparados com uma única aplicação de AgNPs. Dado esse comprovado anteriormente pelas micrografias e mapa composicional da prata obtidos de MEV/EDS. No entanto, diferenças no teor de AgNPs em função do tempo de cura do PDMS não puderam ser detectadas e correlacionadas com as diferenças observadas anteriormente por MEV/EDS.
6.3.3 - Microscopia de força atômica (AFM)
Pela microscopia de força atômica das amostras estudadas foi possível verificar a influência do tempo de cura do PDMS e do método de preparação do revestimento na topografia do revestimento, assim como na dispersão das AgNPs (Figura 18).
Figura 18 - Imagens da área 2D e 3D por AFM da amostra: a) PDMS, b) t0, c) t1/4, d) t1/2, e) t3/4, f) tf e g)
Pode-se observar que a superfície da amostra de PDMS puro apresenta algumas irregularidades superficiais, sendo algumas maiores e outras, bem pontuais. Em todos os casos, essas irregularidades apresentam-se como pontos mais claros nas imagens 2D e protuberâncias nas imagens 3D. Já a superfície do revestimento da amostra t0 apresenta
várias depressões e poucas protuberâncias, havendo um aumento gradativo destas protuberâncias para os revestimentos preparados pelo método de aplicação única, à medida que a aplicação da prata foi realizada em tempos de cura maiores. Na amostra tf
as depressões foram praticamente extintas e pode-se observar um grande número de protuberâncias. Uma vez que o PDMS apresenta-se relativamente menos viscoso no início da cura, a aplicação das AgNPs, provavelmente, provocou depressões na superfície do revestimento, como observado para a amostra t0.
Analisando as demais imagens, tem-se que a quantidade de irregularidades superficiais e pontos mais claros aumentou, à medida que o tempo de início das aplicações de AgNPs aumentou e também, para o revestimento preparado pelo método de múltiplas aplicações. Uma vez que o teor de AgNPs também aumenta seguindo essa mesma tendência, conforme previamente constatado por MEV/EDS e ICP/AES, os pontos mais claros, correspondentes às irregularidades na superfície do revestimento, também foram associados à presença de AgNPs. Assim a Figura 18d, amostra t1/2, apresenta AgNPs
bem dispersa e com apenas alguns aglomerados. Já na amostra t1/4 (Figura 18c), a
dispersão das AgNPs não é homogênea e há aglomerados isolados. No entanto, esses pontos mais claros e/ou irregularidades superficiais apresentam-se na sua maioria como depressões na amostra t1/2 e como protuberâncias na amostra t1/4, indicando que nessa
última amostra, a prata estaria mais exposta na superfície do revestimento. Para as amostras t3/4 (Figura 18e) e tf (Figura 18f), a quantidade de protuberâncias aumentou
significativamente, indicando ainda que as AgNPs também estariam mais expostas na superfície desses revestimentos.
Na amostra tmulti (Figura 18g), pode-se observar todos os comportamentos
apresentados pelas outras amostras de forma simultânea, resultando num revestimento com superfície bem irregular e apresentando AgNPs com diferentes níveis de exposição superficial, em virtude das múltiplas aplicações de AgNPs em tempos variados (t0– tf).
De acordo com as imagens de AFM obtidas para o método de única aplicação, as condições t3/4 e tf seriam as mais recomendadas para aplicação das AgNPs, pois
dos micro-organismos com as nanopartículas. No entanto, o método de múltiplas aplicações seria o mais recomendado por possuir maior quantidade de prata (Tabela 4) e ter uma disposição das nanopartículas de prata intermediária em relação às de única aplicação.
6.3.5 – Determinação do ângulo de contato
As imagens e os resultados das medidas de ângulo de contato (em graus °) constam da Tabela 5 e Figuras 19 e 20.
Tabela 5 - Valores do ângulo de contato para os revestimentos de PDMS puro e PMDS/AgNPs preparados pelos métodos de aplicação única e múltiplas
Amostra Ângulo de contato (°)* PDMS (79,51 ± 0,45) t 0 (79,35 ± 0,98) t 1/4 (81,92 ± 0,37) t 1/2 (77,65 ± 0,40) t 3/4 (86,79 ± 0,42) t f (87,27 ± 2,91)
Figura 19- Gráfico do ângulo de contato das amostras em função do método e do tempo de início da aplicação das AgNPs.
De acordo com a Figura 19, o ângulo de contato das amostras aumentou com o aumento do tempo de início da aplicação das AgNPs, sendo a única exceção a amostra t1/2 (55 min) que apresentou uma leve diminuição no seu ângulo de contato. Logo, as
amostras analisadas tornaram-se relativamente mais hidrofóbicas com o aumento no grau de cura do silicone antes da aplicação das AgNPs, resultado semelhante foi obtido por YOKSAN et al. (2010).
Associando a hidrofobicidade com alterações na rugosidade do revestimento conforme exposto por SEO et al. (2006), esses resultados indicam que os revestimentos de PDMS/AgNPs tornaram-se mais rugosos, à medida que a aplicação da prata foi realizada em tempos de cura maiores. A deposição superficial e em maior quantidade das AgNPs na superfície externa do revestimento de PDMS com o início da aplicação das AgNPs em tempos de cura maiores, conforme previamente constatado por AFM, contribuíram para aumentar a rugosidade e consequentemente, o ângulo de contato dos revestimentos. Com ao aumento da hidrofobicidade com a aplicação das AgNPs nos tempos de cura maiores, temos um acréscimo de uma característica favorável a atividade antimicrobiana da AgNPs, conforme estudo de RADHESHKUMA et al. (2006), onde este aumento da hidrofobicidade favorece a formação de íons Ag+ e a difusão dos mesmo
para o meio. 70 75 80 85 90 95 PDMS t 0 t 1/4 t 1/2 t 3/4 t f tmulti
Ângulo de contato (°)
Figura 20 – Imagens do formato da gota durante a determinação de ângulo de contato dos revestimentos: a) PDMS b) t0 c) t1/4 d) t1/2 e) t3/4; f) tf; e g) tmulti.
Buscando avaliar o efeito da aspersão da solução aquosa de CMC sobre a rugosidade e consequentemente, na hidrofobicidade dos revestimentos, na Tabela 6 e
Figura 21 estão apresentados os dados de ângulo de contato para os revestimentos de
PDMS preparados nas mesmas condições de aplicação do SBSp utilizadas para a obtenção dos nanocompósitos, porém utilizando apenas a solução de água deionizada com CMC, sem AgNPs.
Tabela 6 - Valores do ângulo de contato para os revestimentos de PDMS puro e PMDS aspergido com solução aquosa de CMC preparados pelos métodos de aplicação única e múltiplas
Amostra Ângulo de contato (°)*
PDMS (69,16±0,83) PDMS-t 0 (68,32±1,17) PDMS-t 1/4 (75,78±1,29) PDMS-t 1/2 (71,3±1,23) PDMS-t 3/4 (67,31±0,32) PDMS-t f (65,98±0,41) PDMS-tmulti (66,88±0,37) *Valores correspondentes a média e desvio padrão de 20 medidas.
Figura 21 - Gráfico do ângulo de contato das amostras de PDMS puro em função do método e do tempo de início da aplicação da solução H2O: CMC.
De acordo com esses resultados, o procedimento de aspersão da solução aquosa de CMC praticamente não alterou a hidrofobicidade do revestimento de PDMS, quando efetuado no início da cura do PDMS. Entretanto, tendeu a reduzir a hidrofobicidade dos revestimentos para tempos de cura maiores, ou seja, a rugosidade intrínseca do método de preparação do revestimento de PDMS por aspersão é relativamente reduzida com a
58 60 62 64 66 68 70 72 74 76 78 PDMS PDMS/t 0 PDMS/t 1/4 PDMS/t 1/2 PDMS/t 3/4 PDMS/t f PDMS/tmulti
Ângulo de contato (°)
aspersão de solução aquosa de CMC para tempos equivalentes a ¾ e o final da cura do PDMS. Esse comportamento associa ainda mais o aumento do ângulo de contato dos revestimentos de PDMS/AgNPs (Figura 21) nesses tempos de aplicação, à maior quantidade das AgNPs na superfície externa do revestimento de PDMS.
A única exceção foi o revestimento PDMS-t¼ que apresentou um aumento no
ângulo de contato, implicando numa rugosidade de superfície maior do revestimento de PDMS após aplicação da solução aquosa de CMC. Esse resultado corrobora com a topografia diferenciada observada nas imagens de AFM para esse tempo de aplicação das AgNPs em relação aos tempos t0 e t½ (Figura 19); assim como o maior ângulo de contato
da amostra t¼ em relação à amostra t½ (Figura 21). De acordo com os resultados de MEV/EDS e AFM, apesar do teor de AgNPs da amostra t½ ser relativamente maior, as AgNPs não estão expostas o mais superficialmente possível nessa condição devido às depressões registradas na imagem de AFM (Figura 18d). Por fim, tem-se que a amostra preparada pelo método de múltiplas aplicações tem um comportamento híbrido e mais próximo das últimas condições de aspersão.
Figura 22-Imagens do formato da gota durante a determinação de ângulo de contato dos revestimentos: a) PDMS b) PDMS-t0 c) PDMS-t1/4 d) PDMs-t1/2 e) PDMS-t3/4; f) PDMS-tf; e g) PDMS-tmulti.
6.3.6- Análise de biofilme por fluorescência:
A Figura 23 mostra porcentagens de células viáveis (com membrana celular intacta, e, portanto, com alguma capacidade de sobrevida) aderidas à superfície (biofilme) dos discos em relação à Escala de McFarland (topo de 100%). Embora o erro estatístico seja muito grande (esperado nesse tipo de experimento) observa-se significância estatística em relação aos grupos estudados (com prata) e os controles negativos para cada bactéria isoladamente.
Tabela 7 - Média dos resultados obtidos pelo teste e desvio padrão
% de células viáveis
Amostras
S.aureus
E.coli
Média ± σ Média ± σ t 0 (37,82±6,19) (13,92±2,03) t 1/4 (30,45±9,95) (10,63±2,07) t 1/2 (35,00±3,32) (19,90±5,39) t 3/4 (24,21±4,36) (12,31±2,67) t f (19,58±4,16) (11,80±6,35) tmulti (8,4±2,95) (1,54±1,25) PDMS (75,51±11,26) (34,02±10,66)
Figura 23 - Gráfico dos nº de biofilmes aderidos nas amostras.
0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00 80,00 t 0 t 1/4 t 1/2 t 3/4 t f tmulti PDMS % d e cé lu las v iáv ei s Amostra
Biofilme aderido
De acordo com esses resultados, todos os revestimentos contendo AgNPs, independentementedo método e condições de preparação por SBSp, reduziram a adesão celular e formação de biofilme para S. aureus e E. coli. Em ambos os casos a ação antimicrobiana foi maior para o revestimento preparado pelo método de múltiplas aplicações, ou seja, amostra tmulti, que apresentou-se em média 3,85 e 6,4 vezes,
respectivamente, maior que nos corpos de prova sem prata (19,58% e 11,80%, respectivamente, de células viáveis em relação à Escala de McFarland) Esse comportamento diferenciado se deve ao maior teor de AgNPs e à exposição superficial das nanopartículas no revestimento, conforme previamente evidenciado pelas demais caracterizações realizadas nesse trabalho.
Para as amostras preparadas pelo método de aplicação única, os melhores resultados foram obtidos pelas amostras t¾ e tf, as quais apresentaram relativamente
maior teor de AgNPs, imagens do mapa composicional da prata por MEV/EDS, e cujas nanopartículas se encontram posicionadas mais na superfície externa do revestimento, imagens de AFM, facilitando a interação com os microrganismos estudados. Este fato também explica, mas de forma contrária, os piores resultados obtidos pelas amostras de revestimentos, no caso, t0 e t½, onde as AgNPs estão presentes em menor concentração e
menos expostas superficialmente no revestimento, dificultando o contato com os microrganismos. Um comportamento intermediário foi constatado para a amostra t¼ que apresentou concentração baixa de AgNPs, porém localizadas mais superficialmente no revestimento.
7.CONCLUSÕES:
Nos experimentos iniciais para obtenção de revestimentos por SBSp, constatou- se que os parâmetros que influenciaram a redução da espessura do revestimento foram a distância de trabalho e a rotação do coletor, onde a distância contribuiu para uma maior área de deposição de PDMS no substrato e a velocidade de rotação contribuiu com a uniformidade do revestimento, utilizando força centrífuga.
Para deposição das AgNPs, ou seja, formação do nanocompósito PDMS/AgNPs, verificou-se que para o método de uma única deposição de AgNPs, as amostras com AgNPs depositadas sobre o revestimento de PDMS com maior grau de cura, isto é, de t0 a tf, apresentaram maior atividade antimicrobiana.
No caso das múltiplas aplicações foi observado um comportamento intermediário com relação à morfologia do revestimento, porém uma maior concentração de AgNPs, tendo em vista que este tem suas aplicações de AgNPs em todos os tempos das aplicações únicas. Logo, o melhor resultado de atividade antimicrobiana foi observado para esse