AVRUPADA SOSYAL POLİTİKA GELENEĞİNE KARŞI AB SOSYAL POLİTİKAS

Um biofármaco, também denominado medicamento biológico, pode ser definido como “uma substância farmacêutica, proteína ou ácido nucleico, usada para propósitos terapêuticos ou de diagnósticos in vivo, que é produzida por meios que não aquele da extração direta a partir de uma fonte biológica nativa (não sintética)” (Walsh, 2002). Essa proposta de definição do termo só ocorreu duas décadas depois da produção do primeiro biofármaco feito em larga escala, o hormônio peptídico insulina produzido em E. coli, que passou a ser comercializado pela empresa americana Eli Lilly and Company a partir de 1982 (e que está em vias de ser produzida no Brasil pela Biomm S/A, em associação com a Novo Nordisk). Atualmente, mais de 300 produtos classificados como biofármacos já foram aprovados para comercialização e centenas estão em estágios finais de testes clínicos. Apesar de somente três em cada dez produtos serem aprovados em todas as etapas da fase clínica, esses compostos biológicos compõem uma parcela crescente do mercado da indústria farmacêutica.

O International Market Analysis Research & Consulting (IMARC) estima que o valor em vendas mundiais de biofármacos exceda a marca de US$ 166 bilhões em 2017, o que representa um crescimento de mais de 50% em cinco anos (Authors, 2012) e que certamente irá superar o crescimento de pequenas moléculas terapêuticas (Butler & Meneses-Acosta, 2012). Muito desse sucesso econômico dos biológicos é devido aos anticorpos, cujas vendas globais em 2011 foram estimadas em US$ 44,6 bilhões, representando 36% do valor global total dessas moléculas, seguidos de hormônios na segunda posição, com 21% (US$ 26,02 bi). Já fatores de crescimento ficaram em terceiro lugar, com um total de vendas (US$ 24,78 bi) que representa 20% desse valor. As demais classes de moléculas, como citocinas, proteínas de fusão, enzimas terapêuticas,

vacinas recombinantes, fatores sanguíneos e anticoagulantes, representam parcelas menores desse mercado (Aggarwal, 2011).

Diversos sistemas de expressão já foram desenvolvidos para a produção dessas biomoléculas e muitos outros estão em constante evolução. Atualmente, são usados na indústria farmacêutica células eucarióticas, bactérias, animais transgênicos e síntese direta. Entretanto, o maior número de produtos no mercado são feitos em células de mamíferos e E. coli. Outros sistemas bem explorados são células de insetos (transduzidas com baculovírus) e Picchia pastoris e plantas (Hefferon, 2012; Walsh, 2010; Whittaker, 2013). De qualquer forma, a demanda pela produção de proteínas recombinantes a partir de células de mamíferos continua, principalmente devido a um aumento no número de aprovações dessas moléculas como biofármacos para o tratamento de doenças para as quais não existem boas opções terapêuticas. Essa demanda resultou na melhoria da eficiência de produção, bem como na qualidade dos produtos obtidos desses sistemas de expressão (Butler & Meneses-Acosta, 2012).

No contexto de células mamíferos, muitas linhagens de células murinas foram desenvolvidas, como CHO (ovário de hamster chinês; linhagem onde a maioria dos biofármacos foi produzida), NS0 (mieloma linfoblastoide) e BHK-21 (rim de hamster neonato) (Zhu, 2012). Essas células possuem uma forte maquinaria para síntese de proteínas, garantindo altas taxas de produção das proteínas de interesse. As células CHO, por exemplo, são o sistema predominante para transfecção estável, com uma alta eficiência de produção em larga escala. A produtividade específica dessas células pode chegar a mais de 50 pg/célula/dia, gerando sistemas de cultura que podem produzir acima de 5 g/L em condições ideais (Butler & Meneses-Acosta, 2012). Entretanto, uma desvantagem natural desses sistemas é o fato de possuírem uma maquinaria

celular que resulta na adição de modificações pós-traducionais daquelas presentes no perfil humano.

Dentre os diversos tipos de modificações pós-traducionais existentes, um dos mais relevantes para o contexto de biofármacos é a glicosilação. Glicoproteínas, ou glicoconjugados, possuem grupos de açúcar adicionados enzimaticamente por processos que ocorrem no retículo endoplasmático e no complexo de Golgi. Os resíduos de glicanos são ligados covalentemente na cadeia polipeptídica, normalmente via ligações N ou O. N-glicosilações consistem de uma cadeia de açúcar covalentemente ligada a um resíduo de asparagina (Asn), comumente envolvendo um resíduo de N-acetilglicosamina (GlcNAc) e a sequência peptídica consenso Asn-X-Ser/Thr. N- glicanos compartilham um núcleo de pentassacarídeo e podem ser divididos em três classes: tipo oligomanose (ou alta manose), tipo complexo e tipo híbrido. Por outro lado, O-glicosilações geralmente envolvem a ligação de um resíduo de N-acetilgalactosamina (GalNac) a um grupo hidroxil de um resíduo de serina (Ser) ou treonina (Thr) e apresentam uma grande variedade de núcleos estruturais (A, Cummings, & Esko, 2009). Essas estruturas de glicanos chegam a formar complexas redes ramificadas que garantem o correto enovelamento proteico, o tempo de meia- vida e, muitas vezes, a atividade biológica das proteínas às quais são ligadas. Além disso, a variação entre animais de espécies diferentes pode resultar na geração de proteínas impróprias para o uso seguro em humanos quando produzidas em sistemas heterólogos.

Alternativamente, existe um número grande de tipos celulares disponíveis para a produção de proteínas glicosiladas que tenham modificações pós-traducionais com compatibilidade imunológica para uso em seres humanos. É o caso de células PER.C6, derivadas de células de retina embrionária humana transformada com o adenovírus E1 (Havenga et al., 2008), que possuem vantagens importantes para a produção de proteínas recombinantes.

Primeiramente, foi mostrado que elas são capazes de atingir grandes densidades em cultura em suspensão, da ordem de 108 células/mL, e titulações de proteínas secretadas de 8 g/L em sistema de batelada alimentada ou 25 g/L em culturas de perfusão (Kuczewski, Schirmer, Lain, & Zarbis- Papastoitsis, 2011). Além disso, por serem células humanas, o perfil de glicosilação das glicoproteínas produzidas é totalmente do tipo humano. Um exemplo dessa vantagem é o da produção de eritropoietina. Quando produzida em células PER.C6, essa proteína estava livre de ácido glicolilneuramínico (Neu5Gc), uma modificação que pode ser imunogênica, enquanto que a produção em células CHO resulta na presença de quantidades significantes desse ácido (Diaz et al., 2009).

Por serem de origem humana, as células HEK293, de rim embrionário (Human

Embryonic Kidney), também possuem um sistema de modificação pós-traducional que garante a

segurança de proteínas terapêuticas superexpressas, somado ao fato de possuírem uma robusta maquinaria de síntese proteica e alta taxas de replicação (Thomas & Smart, 2005). Essas células são amplamente usadas para a rápida produção de proteínas recombinantes e partículas virais em escala laboratorial, inclusive no modelo de cultura em suspensão na ausência de soro (Ghani et al., 2006). Sistemas baseados no crescimento de células em suspensão têm a vantagem de não apresentarem a inibição por contato e poderem crescer em altas densidades, ao contrário de culturas aderentes, que acabam tendo uma limitação no rendimento de produção. Além disso, essas células têm melhor escalabilidade e simplificam processos subsequentes e as etapas de purificação, fora o fato de apresentarem menor risco de contaminação (Arthuso, Bartolini, & Soares, 2012; Beyer et al., 2009; Link et al., 2004; Swiech et al., 2011; Tsao, Condon, Schaefer, Lio, & Liu, 2002). Entretanto, células em suspensão, especialmente no caso de células HEK293, tendem a formar agregados celulares que podem levar a alterações metabólicas e de propagação,

podendo reduzir a produção de proteínas recombinantes quando comparado com culturas aderentes (Guy, McCloskey, Lye, Mitrophanous, & Mukhopadhyay, 2013; Tsao et al., 2002). O melhoramento de sistemas mamíferos de expressão, como é o caso da linhagem HEK293, ainda está sendo explorado, visando o aumento da produção e a geração de biofármacos seguros (Butler & Meneses-Acosta, 2012; Thomas & Smart, 2005; Zhu, 2012).

2 _OBJETIVOS