I. BÖLÜM
1. Yerküre Anlamında Arz
1.3. Arzın Yuvarlak Olması
Nesta secção serão descritos os resultados da PCA para a EF com laser de excitação de 408nm. A figura 20 mostra o resultado obtido para os dois primeiros componentes principais.
Figura 20. PCA para os espectros obtidos com laser de 408nm. O primeiro componente principal (PC01) explica 75,50% da variância do conjunto original de dados. O PC02 explica 19,4% da variância.
Novamente, é possível distinguir entre os dois grupos: em duas regiões no gráfico há predominantemente pontos de cada tipo (normal ou atrófico). Entretanto, mais uma vez, ocorre a sobreposição dos grupos e a resolução da separação é limitada.
●Normal
5 – DISCUSSÃO
Análogos sintéticos de GC constituem uma classe de antiinflamatórios, amplamente utilizada no tratamento de doenças inflamatórias agudas e crônicas há mais de 50 anos (JACKSON; GILCHRIST; NESBITT; 2007). Os excelentes efeitos terapêuticos dos GC como antiinflamatório e imunossupressor são, freqüentemente, acompanhados por graves e, algumas vezes, irreversíveis efeitos colaterais. Esses efeitos, que variam de acordo com o método de administração, o tempo de exposição à droga e a dose utilizada, podem incluir: diabetes mellitus, úlcera péptica, síndrome de Cushing com supressão do eixo hipotálamo-hipófise-adrenal, osteoporose, atrofia cutânea, psicose, glaucoma, entre outros; ficando o uso dos GC limitado por estas implicações (HENGEE 2006). Quando administrados topicamente, os GC inibem a proliferação de fibroblastos, causando como principal efeito adverso a atrofia cutânea
(STERRY; ASADULLAH, 2002
)
. Além de ser o efeito colateral mais comum do uso tópico de GC, a atrofia cutânea é estudada por razões estéticas.Para compreender melhor os mecanismos que levam a atrofia de pele induzida por GC, foram criados modelos in vivo que mimetizam esse indesejado efeito em animais como camundongos, ratos, porcos e cães; sendo possível obter resultados satisfatórios que reproduzem com sucesso as características clínicas e histopatológicas observadas no atrofiamento cutâneo em seres humanos, inclusive o enfraquecimento e a queda de pelo, que normalmente acompanham a atrofia (SHEU et al., 1998; SCHAKE et al., 2004; LAVKER et al.,1991; KIMURA; DOI, 1999). Animais sem pelos, modificados geneticamente, são muitas vezes os preferidos para os modelos de atrofia cutânea, pois não há necessidade de tricotomia, o que diminui a irritação da pele. Contudo, esses animais requerem cuidados especiais e são mais dispendiosos (SCHAKE et al., 2004). Além disso, ao se escolher um modelo experimental baseado em um animal sem pelo, não é possível avaliar o efeito de possíveis tratamentos na reversão da queda de pelos.
Para estudar o efeito de GC na pele, ensaios in vitro também são costumeiramente realizados, por serem de resposta rápida, pouco dispendiosos e possíveis de serem realizados com poucos componentes. É possível observar efeitos de GC na proliferação celular em culturas de fibroblastos e queratinócitos, contudo esses ensaios se distanciam bastante das condições fisiológicas normais do corpo humano, sendo pouco úteis para refletir todos os aspectos da atrofia cutânea no nível histológico (SCHOEPE et al., 2009; SCHOEPE, 2009).
No presente estudo, buscou-se uma metodologia adequada para indução de atrofia cutânea por glicocorticóide em rato Wistar, linhagem popular usada como modelo de estudo em várias situações. Os resultados histológicos, após 14 dias de aplicação tópica do glicocorticóide propionato de clobetasol a 0,05%, mostraram a progressão da atrofia na pele de todos os animais. A maioria das biópsias foi avaliada como tendo atrofia de grau moderado a acentuado, comprovando a eficácia do modelo animal para esse estudo. O diagnóstico da atrofia foi confirmado pela medição em micrômetros da espessura da epiderme, com o auxílio do programa Image Tool®, que permitiu analisar com rapidez e precisão as imagens documentadas das biopsias realizadas no primeiro dia e após 14 dias de tratamento com GC. Além da medição da espessura da epiderme, outros parâmetros já foram usados para avaliar atrofia cutânea em modelos animais: a contagem de camadas celulares das biopsias, a mensuração da perda de água transepidermal e a força necessária para ruptura da pele em biópsias (SCHOEPE, 2009). A padronização bem sucedida desse modelo experimental em rato Wistar permitirá o seu uso em outras pesquisas do nosso grupo, dando continuidade ao um projeto maior que busca investigar os efeitos de ligantes de hormônios tireoideanos no tratamento de atrofia cutânea e na queda de pelos, visando possíveis aplicações na área médico-farmacêutica.
A coloração de Picrosirius red, associada à microscopia polarizada, apresenta importante sensibilidade e especificidade na análise histológica das fibras colágenas
(MONTES; JUNQUEIRA, 1991) e tem sido utilizada para avaliar o processo de cicatrização de feridas da pele, sendo possível correlacionar a quantidade e a qualidade do colágeno com o resultado da cicatrização final (CUTTLE; NATAATNADJA; FRASER, 2005). Em 2003, esta técnica permitiu caracterizar as alterações na derme e na epiderme de ratas Wistar castradas e com hipotireoidismo, que apresentaram adelgaçamento da epiderme da região abdominal ventral, espessamento e aumento da celularidade na região torácica dorsal, com derme adelgaçada e desprovida de fibras elásticas e de colágeno do tipo III (FERREIRA et al., 2003). Em 2008, o estudo histológico com coloração Picrosirius red foi utilizado para analisar a disposição de fibras de colágeno tipos I e III em implantes labiais feitos com hidroxiapatita de cálcio (BERLIN; HUSSAIN; GOLDBERG, 2008). Em estudos sobre fibrose cardíaca (STEMPIEN-OTERO et al., 2006) e carcinomas (HATA et al., 2008), a coloração com Picrosirius red também se tem mostrado eficiente na análise das fibras colágenas.
No presente estudo, utilizou-se a coloração Picrosirius red para avaliar a quantidade e a qualidade do colágeno na pele com atrofia induzida por GC. Observou- se que, após 14 dias de clobetasol, a derme apresentava diminuição da espessura, com aumento do colágeno do tipo I, em detrimento do colágeno III, geralmente ausente. Em algumas biópsias classificadas como atróficas, as fibras colágenas apresentaram rearranjo mais grosseiro e desorganizado. Pareceu-nos que tais alterações foram decorrentes da compactação do colágeno tipo I pré-existente, conseqüente à redução da espessura da pele. Alguns trabalhos indicam decréscimos da quantidade de colágeno do tipo I e III em pele humana (AUTIO et al., 1994; PONEC et al., 1979) e em pele de ratos (SHULL; CUTRONEO, 1983; OISHI et al., 2002) com atrofia cutânea. Uma das causas apontadas para a redução dessas proteínas é o fato dos GC afetarem a síntese de colágeno indiretamente, por redução do prolil-4- hidroxilase (P4h), que cataliza a hidroxilação de resíduos de prolina em ligações
peptídicas e, portanto, estabiliza a estrutura de tripla hélice do colágeno. (CUTRONEO; STASSEN; CARDINALE, 1975; OIKARINEN; HANNUKSELA, 1980). As metaloproteínas de matriz extracelular (conhecidas como MMP), que participam do
turnover do colágeno, podem também ser afetadas pelos GC. Em tratamentos com
GC em humanos, por exemplo, o efeito do medicamento causa decréscimo na produção de RNAm e de proteínas MMP1 e MMP2 (OIKARINEN et al., 1998; KYLMANIEMI et al., 1996). Portanto, uma outra forma de investigar e quantificar as mudanças das fibras colágenas na atrofia cutânea pode ser o estudo da expressão do RNAm e da proteína colágeno na pele.
A pele é um dos tecidos mais investigados por meio da espectroscopia óptica, tanto na faixa do espectro visível, quanto no ultravioleta, por causa do fácil acesso e das diferentes propriedades ópticas decorrentes das diferenças de pigmentação. No entanto, a pele é um órgão complexo e heterogêneo composto por três camadas - epiderme, derme e hipoderme - com diferentes propriedades ópticas, o que dificulta a análise quantitativa da EF (DRAKAKI et al., 2009).
Os espectros de emissão de fluorescência são fortemente influenciados pela absorção, re-absorção e espalhamento de luz no tecido, o que varia de acordo com os fluoróforos presentes nas diferentes camadas da pele e com o estado metabólico do tecido (RAMANUJAM, 2000). O alcance da profundidade do tecido examinado depende do comprimento de onda utilizado. Tipicamente, a profundidade do laser é da ordem de 100µm nos menores comprimentos de onda do espectro visível (400nm) e de 700µm nos maiores comprimentos de onda (700nm) (KOLLIAS e STAMATAS, 2002).
Nesse trabalho, foram usados comprimentos de onda de 408nm, que penetra na pele cerca de 100µm, e 532nm, que penetra cerca de 300µm, o que significa que foi feita avaliação da derme, não da epiderme. Está bem determinado na literatura que com comprimentos de onda menores que 315nm o sinal de fluorescência emitido tem
origem na epiderme, enquanto que com comprimentos de onda maiores que 315nm a fluorescência tem origem dermal também (KOLLIAS e STAMATAS, 2002). Como a espessura da epiderme diminui consideravelmente mais rápido que a espessura da derme durante o tratamento com corticóide, seria melhor usar as freqüências do espectro ultravioleta para avaliar os efeitos potenciais de atrofia causado pelo glicocorticóides. Embora, por refletirem alterações dérmicas, os comprimentos de onda usados nesse trabalho possam ser menos sensíveis para detecção precoce de atrofia induzida por GC, para que a técnica de EF possa ser aplicada na clínica o ideal é que sejam utilizados espectros de luz na faixa do visível (300 a 700nm), que têm menor potencial ionizante, evitando efeitos secundários indesejados do laser (ablação, queimaduras), o que justifica a escolha dos comprimentos de onda utilizados neste trabalho.
Estudos em humanos mostram que, com a excitação ultravioleta de 365nm, a profundidade de penetração ficou limitada entre 20-50µm (MASTERS et al., 1997) e o espectro tem um pico de 475nm (LOHMANN e PAUL, 1988; CHWIROT et al., 1998). Brancaleon et al. (2001), utilizando laser de comprimento de onda de 295nm, encontraram um pico espectral de cerca de 340nm, e com laser de 350nm, o pico foi de 470nm. Bliznakova et al. (2007), investigando pele humana utilizando laser com comprimento de onda de 405nm, encontraram uma banda de emissão máxima próxima de 510nm, o que é muito parecido com o presente resultado quando utilizamos laser de excitação com emissão em 408nm e encontramos um pico espectral principal localizado aproximadamente em 510nm.
A origem da autofluorescência da pele não é totalmente compreendida. Vários autores sugerem que os principais fluoróforos endógenos responsáveis pelo autofluorescência da derme são as fibras cruzadas de colágeno e de elastina (Tabela 9), cujas fluorescências máximas estão em 460-490nm e 500-540nm, respectivamente (LEFFELL et al., 1988; CHWIROT et al., 1998; KOLLIAS e STAMATAS, 2002;
BLIZNAKOVA et al., 2007; DRAKAKI et al.,2009). Outros autores relacionaram a autofluorescência da pele principalmente ao NADH e ao FAD, que têm fluorescências máximas em torno de 440-460nm e 535nm, respectivamente (LOHMANN e PAUL, 1988; LOHMANN et al., 1991). Com o aumento da excitação do comprimento de onda, novos fluoróforos são envolvidos na formação da estrutura do espectro fluorescente. Tabela 9. Lista dos principais fluóforos presentes na pele, com seus respectivos valores de excitação e emissão máximas*.
Fluóforos endógenos Descrição Excitação máxima Emissão máxima
Colágeno Proteína estrutural 325, 360 400, 405
Fibras cruzadas de colágeno Proteína estrutural 370 460-490
Elastina Proteína estrutural 290, 325 340, 400
Fibras cruzadas de elastina Proteína estrutural 420-460 500-540
Queratina Proteína estrutural 370 460-500
FAD e Flavinas Coenzima 450 535
NADH Coenzima 290, 350 440, 460
Fosfolipídios Lípidios 340-440 430-460, 540-560
Ceroíde e Lipofucsina Lípidios 340-395 430-460, 540
Triptonano Aminoácido 280, 295 345, 350 Tirosina Aminoácido 275 300 Fenilalanina Aminoácido 260 280 Vitamina A Vitamina 327 510 Vitamina K Vitamina 335 480 Vitamina D Vitamina 390 480
Vitamina B6 Piridoxina Vitamina 332, 340 400
Vitamina B6 Piridoxamina Vitamina 335 400
Vitamina B6 Piridoxal Vitamina 330 385
Vitamina B6 Ácido Piridoxico Vitamina 315 425
Vitamina B6 5’ Piridoxal Fosfato Vitamina 330 400
Vitamina B12 Vitamina 275 305
Porfirinas Porfirinas 400-450 630, 690
* Adaptada de RAMANUJAM, 2000; KOLLIAS; STAMATAS, 2002; BLIZNAKOVA, 2007.
As diferenças espectrais observadas na pele com e sem atrofia, com laser de excitação com emissão em 532nm são muito pouco pronunciadas, com deslocamento do pico de fluorescência de 610nm na pele normal para 570nm na pele atrofiada, o que deve refletir alterações do metabolismo. Com o laser de comprimento de onda de 408nm, a característica da pele normal no máximo foi na região de 510nm; na pele atrofiada, além do pico espectral principal de 510nm, surgiram outros três picos de 557nm, 633nm e 670nm. Especialmente os picos de 633nm e 670nm se mostraram sensíveis para detectar a diferença entre pele normal e atrófica. Acreditamos que isso se deu porque, com a diminuição da espessura da pele, redução do número de queratinócitos, de fibras de colágenos e elastina, afrouxamento da MEC e diminuição do metabolismo tecidual, com conseqüente diminuição de FAD e NAD, o laser de 408nm detectou fluorescências de camadas mais profundas da derme, e mais elementos contribuíram para o sinal fluorescente, como as porfirinas, que têm emissão máxima entre 630-690nm (RAMANUJAM, 2000).
Com a EF, o melhor resultado obtido foi, sem dúvida, a avaliação de parâmetros espectrais com laser de 408nm. A linha magenta na Figura 21 mostra uma possível fronteira de decisão com base nesses resultados. Acima desta linha os espectros podem ser classificados como atróficos e abaixo dela como normais. Para aumentar mais ainda a precisão e certeza na tomada de decisão sobre atrofia ou não da pele avaliada, pode-se complementar essa análise com resultados da PCA, embora esta última deva ser somente usado para apoiar a conclusão obtida com base na análise de R633 e R670.
Figura 21. Avaliação dos índices R633 e R670. A reta magenta mostra uma possível
fronteira de decisão.
O estabelecimento de uma fronteira de identificação entre pele normal e atrófica, foi prejudicado, especialmente, pelo comportamento do animal 09, no qual alguns fragmentos considerados normais pela análise histológica, tiveram padrão espectral de pele atrófica. Nós acreditamos que é possível que os dados espectrais desse animal reflitam alterações metabólicas na derme que ainda não se manifestaram histologicamente, uma vez que as técnicas de diagnóstico baseadas em EF têm o potencial de reunir as propriedades bioquímicas e morfológicas do tecido (RAMANUJAM, 2000); e os sinais espectroscópicos podem indicar mudanças bioquímicas, que geralmente precedem as mudanças morfológicas (BAGNATO et al., 2010).
Com a PCA, foi possível fazer a distinção entre os grupos normal e atrófico tanto para os espectros obtidos com laser de 532nm, quanto para os espectros obtidos com laser de 408nm. Entretanto esta distinção não foi tão pronunciada e, em ambas
●Normal
as PCA (532 e 408nm), há regiões de sobreposição dos grupos normal e atrófico, o que prejudica a classificação baseada nessa análise.
Apesar de não ter sido possível reconhecer um algoritmo com alto grau de resolução na identificação da atrofia, os resultados apresentados mostram o potencial da espectroscopia de fluorescência para essa avaliação. Serão necessários mais estudos para explicar como cada fluoróforo contribui para o espectro de fluorescência na pele normal e na pele atrófica, o que, por sua vez, contribuirá para um melhor entendimento da atrofia causada por GC. Uma vez entendido esse processo, a espectroscopia de fluorescência pode representar um importante passo para o avanço da detecção de efeitos colaterais e no monitoramento de tratamentos com uso de GC.
6 – CONCLUSÕES
Os resultados deste estudo mostraram:
1. O uso do glicocorticóide propionato de clobetasol a 0,05% diariamente, durante 14 dias consecutivos, é capaz de induzir atrofia cutânea em ratos Wistar.
2. Em situações de atrofia cutânea há alteração na distribuição e no arranjo das fibras colágenas na derme, especialmente nas fibras de colágeno tipo I.
3. A análise dos espectros de fluorescência obtidos com laser de excitação em 532nm e 408nm aponta para uma possível distinção espectral entre pele normal e pele atrófica, com o comprimento de onda de excitação em 408nm sendo mais adequando para essa análise. No futuro, a espectroscopia de fluorescência poderá ser usada como método de diagnóstico completar na área da dermatologia.
7 - REFERÊNCIAS
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