Antimikrobiyal aktivite tayini

3.2.6.1. Bakteri ve Fungus Kültürlerinin Hazırlanması

Mikroorganizmalar, Doç Dr. İsa KARAMAN tarafından Gazi Osman Paşa Üniversitesi Biyoloji Bölümünde oluşturulan kültür koleksiyonundan sağlanmıştır. Ependorf tüplerde – 80 Co_{‟ de saklanan bakteri ve funguslardan, çalışmada} kullanılacak olanları laboratuvara getirelerek çalışma anında çözdürülmek üzere buzdolabının derin dondurucusunda tutulmuştur. Funguslar, önceden hazırlanıp otoklavda steril edilen potato dekstrose agara, bakteriler ise müller hinton agar besiyerine ekim yapılmak üzere dondurucudan çıkarılıp oda sıcaklığında çözülmeleri sağlanmıştır. Mikroorganizmalar bulundukları tüplerden otomatik pipetle 20 μl çekilerek katı besi yerlerine bırakılmış, çizgi ekimi yapılarak tekrar – 80‟ e konulmuştur.

3.2.6.2. Disk Difüzyon Yöntemi

Bu yöntem “Kirby-Bauer Disk Difüzyon Test Protokolü” ne göre uygulanmıştır. Mikrobiyoloji labotauvarlarının çoğunda kullanılan yöntemde, belirli yoğunluktaki bakteri besiyerine yayılır ve antibiyotik emdirilmiş diskler bunun üzerine yerleştirilir. Bir gecelik inkübasyondan sonra diskin çevresindeki inhibisyon zon çapı ölçülerek bakterinin diske emdirilmiş antibiyotik maddeye karşı duyarlılık düzeyi saptanır (Hudzicki, 2009; Anonim 2006).

0,5 McFarland standardına göre ayarlanan bakteriler MHA ortamına steril eküvyon çubuk kullanılarak yayma ekim tekniği ile ekildi. Ekim yapıldıktan hemen sonra sekize ayırıp işaretlediğimiz besiyerlerinde ilgili alana 6 mm çapında bir boş disk yerleştirilerek ekstraksiyonunda kullanılan 2 ml solventte 200 mg çözdürülmüş ekstrakttan 20 mikrolitre emdirildi. Böylece her bir 6 mm çapındaki boş diske 2 mg ekstrakt eklenmiş oldu. Bu işlem tüm ekstrelerle her bir bakteri için tek tek uygulandı. Besi yerine aynı zamanda, pozitif kontrol olarak sulbactam-cefoperazona ve imipenem antibiyotik diskleri, negatif kontrol olarak ise 20 μl metanol emdirilmiş diskler yerleştirildi. 36,5 °C‟de 1 günlük inkübasyondan sonra disklerin oluşturduğu inhibisyon zonları ölçülerek kaydedildi.

Daha önce stoktan alınarak PDA besiyeri ortamında çoğaltılan funguslar yine PDA ortamına steril eküvyon çubuklar kullanılarak sporları dağıtıldı. Bakteriler için uygulanan ekstrelerin disklere emdirilme işlemi burada da uygulandı. Besiyerlerine aynı zamanda pozitif kontrol olarak flucanazol ve nystatin antifungal diskleri, negatif kontrol olarak metanol emdirilmiş diskler yerleştirilip 36,5 °C‟ de 2 günlük inkübasyondan sonra disklerin oluşturduğu inhibisyon zonları ölçüldü. Disk difüzyon tekniği az masraflı, az zahmetli ve kolay uygulanır olması sebebiyle tercih edilmektedir. Ayrıca, bu teknikle bir petri kutusunda 5-6 antibiyotiğe karşı duyarlılığı belirlemek ve en etkili olan maddeyi saptamak mümkündür (Arda 2000). Disk Difüzyon; tüm ekstraktlar için iki tekrarlı gerçekleştirildi.

3.2.6.3. Mc Farland Bulanıklılık Tüpü

0,5 Mc Farland standardına uygun bulanıklık tüpü hazırlamak için:

0,048 M BaCl2 (0,5 ml) + 0,18 M H2SO4 (99,5 ml) = 0,5 Mc Farland = 108 _cfu/ml Baryum klorür ve sülfirik asit kullanılarak hazırlanan bu solüsyon vidalı kapaklı deney tüplerine 5‟er ml ilave edilerek oda sıcaklığında, karanlıkta saklanmıştır (Unat, 1986).

3.2.6.4. Bakteri Süspansiyonlarının 0.5 Mc Farland’ a Göre Ayarlanması

Otoklavda steril edilmiş deney tüplerine 5‟ er ml steril Müller Hinton Broth sıvı besi yeri dağıtılmıştır. Katı besiyerinde çoğaltılmış stok kültürlerden platin öze ile sürüntü alınıp her bir tüpe ekilerek 18 saat 36.5 Co‟ inkübe edilmiştir. Daha sonra bakteri süspansiyonu sayısı kadar deney tüplerine 9‟ ar ml Müller Hinton Broth sıvı besi dağıtılmış ve sıvı besiyerlerinde çoğaltılmış bakteri süspansiyonlarından 1‟ er ml alınarak bu tüplere ilave edilmiştir. Süspansiyonlar Mc Farland bulanıklık tüpleri ile karşılaştırılarak 1 x 108

cfu/ml sayıda bakteri varlığı sağlanmıştır.

3.2.6.5. Minimum Ġnhibisyon Konsantrasyonu (MIC) Belirlenmesi

Antibakteriyal maddelerin in vitro etkinliğini belirlemede başlıca iki kriter esas alınmaktadır. Bunlar Minimum İnhibisyon Konsantrasyonu (MİK veya MIC) ve diğeri de Minimum Bakterisidal Konsantrasyon'dur (MBK veya MBC).

MIC; antibakteriyel maddenin patojenin gelişmesine engel olan en düşük yoğunluğudur. MIC değeri, antimikrobiyal maddenin bakteriyostatik (inhibitör) etkisini ölçer. MIC tayini ile disk difüzyon yöntemi ile belirlenmiş anlamlı zon oluşturan ekstraktların hızla çoğalan bakterilere karşı bakteriostatik etki düzeyleri tespit edilmiştir (Arda 2000). MIC değerleri tespit edilirken Müller Hinton Broth sıvı besi yeri kullanılmıştır. Üzerinde etkili olduğu görülen her bir bakteri ve ekstrakt için kapaklı tüplerden 10‟ ar adet seriler hazırlanarak her tüpe ayrı ayrı 2‟ şer ml sıvı besi yerinden dağıtılmıştır. Daha sonra ilgili ekstraktlardan 4‟er mg tartılarak 4 ml kendi solventinde vortexlenerek homojen karışım sağlanmıştır. Elde edilmiş çözeltilerden 1. tüplere 2‟ şer ml ilave edilmiştir. 1. tüplerden başlayarak 9.tüpe kadar bir önceki tüpten 2 ml çekilip sonrakine

eklenerek seyreltme işlemi gerçekleştirildi. Böylece bir sonraki tüpte bir öncekinin yarısı kadar ekstrakt bulunması sağlandı. Bu seyreltmenin amacı; etken maddenin minimum inhibisyon konsantrasyonunu, bakterinin tüplerde bulanıklık oluşturamadığı ilk tüpteki miktarını kaydederek belirlemektir. 10. tüpe ise ekstrakt ilave edilmedi, bu tüpe yalnızca bakteri eklenerek kontrol tüpü olması sağlandı. Bu aşamadan sonra her bir tüpe 0.5 McFarland standarda göre ayarlanmış ilgili bakteri süspansiyonundan 1‟ er ml eklenerek 36.5 C˚ „ de 24 saat inkübe edildi. İnkübasyon sonrası her bir seri tüplerde belli bir tüpten sonra gözle görülür net bir bulanıklığın olduğu ve sonraki tüplerde bu bulanıklığın devam ettiği görüldü. Bulanıklığın başladığı tüpten bir önceki tüp etken maddenin MIC değeri olarak kaydedildi (Andrews 2001, Lalitha 2004). Ayrıca MIC değeri tespitinde pozitif kontrol olarak sulbactam cefoperazona, negatif kontrol olarak etken maddenin ekstraksiyonunda kullanılan solvent kullanılmıştır. MIC değeri tespiti bütün ekstrakt ve solventler için iki tekrarlı yapıldı. Bulunan sonuçların ortalaması MIC değeri olarak kaydedildi.

3.2.6.6. Minimum Bakterisidal Konsantrasyonu (MBC) Belirlenmesi

MBC; antibakteriyal maddenin, patojeni öldüren en düşük yoğunluğudur. MBC değeri, antibakteriyel maddenin bakterisidal etkisini gösterir. MBC değeri genellikle MIC değerinden 2 - 4 kat fazladır (Arda 2000). MBC değeri aranırken MIC değeri olarak saptanan tüpten geriye doğru 1.tüpe kadar, steril edilmiş ahşap kürdanlar, bulanık olmayan tüplerdeki süspansiyonlara dokundurulup Müller Hinton Agar besiyerine nokta ekimi yapılmıştır. Bir gecelik inkübasyon sonunda katı besiyerinde üremenin görülmediği ilk konsantrasyon MBC değeri olarak saptanmıştır( Lalitha 2004). Test iki tekrarlı yapılmıştır.

4. ARAġTIRMA SONUÇLARI