Afişin hazırlanması

O uso da Microscopia Eletrônica de Varredura para análise do crescimento microbiano e sua atividade enzimática sobre substratos lignocelulósicos tem sido empregada como uma interessante alternativa para estudos de Cultivo Sólido e Submerso. De acordo com

68 Papagianni (2004), a produção de metabólitos fúngicos em condições industriais é influenciada pela forma morfológica desenvolvida. Além disso, o sucesso da produção de um metabólito está associado a um conhecimento das características de crescimento e da fisiologia do fungo, visto que não só a produção de metabólitos diferentes requer diferentes condições fisiológicas, mas também cada fungo é único no seu desenvolvimento anatômico, morfológico e fisiológico.

Neste trabalho, a técnica de Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) foi realizada afim de monitorar a colonização do meio de cultivo e a morfologia do fungo ao longo do processo. Como pode ser verificado nas Figuras 5.11 A-D, em 24 horas de cultivo, observa-se a primeira evidência fenotípica de especialização das hifas, os conídios, que são estruturas de reprodução do ciclo assexuado dos ascomicetos. Observa-se ainda intensa formação de ramificações, como anteriormente constatado através da microscopia ótica na Figura 5.7D, correspondendo à fase de crescimento acelerado definida através dos ensaios de determinação de N-acetilglicosamina.

Em 48 horas de cultivo nota-se a intensa colonização da hifa sobre o substrato através de ramificações, e o encontro das microcolônias, como pode ser verificado nas Figuras 5.12 A-D. Em 72 e 96 horas (Figuras 5.13 A-D e 5.14 A-D), que corresponde a fase estacionária de crescimento, nota-se a diminuição do número de hifas e uma maior interação entre as colônias. Segundo Mitchell e colaboradores (2000), nesta fase, as microcolônias se encontram, podendo ocorrer muitas interações entre pontas de hifas e entre hifas. Além disso, algumas pontas de hifas podem parar de se estender, como consequência das intensas interações e formação de colônias. A depleção nutricional e o acúmulo de inibidores também podem afetar o crescimento.

A análise do crescimento também revelou que em 120 horas (Figura 5.15) de cultivo houve fragmentação da estrutura do bagaço de cana. Um provável mecanismo está

69 relacionado à ação física do crescimento fúngico sobre o substrato e sua ação enzimática. Como demonstrado, essa linhagem apresenta um pico de produção de enzimas hidrolíticas, como celulases e xilanases na fase estacionária e de declínio.

Figura 5.11. – Eletromicrografia (microscopia eletrônica de varredura – MEV) de bagaço de cana-de-

açúcar e farelo de trigo após 24 horas de cultivo de Myceliophthora thermophila M.7.7.

a) Visão geral da superfície do bagaço de cana-de-açúcar (*) e do aglomerado micelial (setas) 400X – barra= 400 µm.

b) Em maior aumento a superfície do material. 1000X – barra= 100 µm. c) Detalhe do fungo mostrando os conídios (setas). 2000X – barra= 50 µm.

d) Detalhe do fungo. Observe a ramificação lateral das hifas (seta) e os conídios (*). 4000X – barra= 20 µm.

A

B

C

D

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Figura 5.12. – Eletromicrografia (microscopia eletrônica de varredura – MEV) de bagaço de cana-de-

açúcar e farelo de trigo após 48 horas de cultivo de Myceliophthora thermophila M.7.7.

a) Visão geral da superfície do bagaço de cana-de-açúcar (*) e do fungo (setas) associado. 400X – barra= 400 µm.

b) Aumento da densidade micelial 1000X – barra= 100 µm.

c) Detalhe do fungo mostrando as ramificações das hifas (setas). 2000X – barra= 50 µm. d) Detalhe do fungo. Observe as hifas (seta) e os conídios (*). 4000X – barra= 20 µm.

A

B

C

D

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Figura 5.13. – Eletromicrografia (microscopia eletrônica de varredura – MEV) de bagaço de cana-de-

açúcar e farelo de trigo após 72 horas de cultivo de Myceliophthora thermophila M.7.7.

a) Visão geral da superfície do bagaço de cana-de-açúcar (*) e do fungo (setas) associado. 400X – barra= 400 µm.

b) Em maior aumento a superfície do material. 1000X – barra= 100 µm.

c) Detalhe mostrando a formação de colônias miceliais (setas). 2000X – barra= 50 µm. d) Detalhe do fungo. Observe as hifas (seta) e os conídios (*). 4000X – barra= 20 µm.

A

B

D

C

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Figura 5.14. – Eletromicrografia (microscopia eletrônica de varredura – MEV) de bagaço de cana-de-

açúcar e farelo de trigo após 96 horas de cultivo de Myceliophthora thermphila M.7.7.

a) Visão geral da superfície do bagaço de cana-de-açúcar (*) e do aumento da formação de colônias do fungo (setas) associado. 400X – barra= 400 µm.

b) Em maior aumento a superfície do material. 1000X – barra= 100 µm.

c) Detalhe mostrando a ramificação lateral das hifas (setas). Observe a diminuição da quantidade de hifas. 2000X – barra= 50 µm.

d) Detalhe do fungo. Observe as hifas (seta) e os conídios (*). 4000X – barra= 20 µm.

A

B

D

C

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Figura 5.15. – Eletromicrografia (microscopia eletrônica de varredura – MEV) de bagaço de cana-

de-açúcar e farelo de trigo após 120 horas de cultivo de Myceliophthora thermophila M.7.7.

a) Aspecto quebradiço da superfície do bagaço de cana-de-açúcar (*) e dos aglomerados de conídios (setas) associado. 400X – barra= 400 µm.

b) Em maior aumento o aspecto quebradiço do bagaço de cana-de-açúcar. 1000X – barra= 100 µm.

c) Detalhe do fungo mostrando a formação de novas hifas (setas). 2000X – barra= 50 µm. d) Detalhe do fungo. Observe a formação de novas hifas (seta) e os conídios (*). 4000X –

barra= 20 µm.

A

B

D

C

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Figura 5.16. – Eletromicrografia (microscopia eletrônica de varredura – MEV) de bagaço de

cana-de-açúcar e farelo de trigo após 144 horas de cultivo de Myceliophthora thermophila M.7.7. a) Visão geral da superfície do bagaço de cana-de-açúcar (*) e a formação de novas hifas

sobre o s conídios (setas) associado. 400X – barra= 400 µm.

b) Em maior aumento a superfície do material. 1000X – barra= 100 µm. c) Detalhe do fungo mostrando as hifas (setas). 2000X – barra= 50 µm.

d) Detalhe do fungo. Observe as hifas (seta) e os conídios (*). 4000X – barra= 20 µm.

A

B

C

D

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75 5.9.Processamento digital de imagens

As Figuras apresentadas abaixo ilustram o acompanhamento das análises de imagens, a fim de monitorar a área de crescimento da biomassa do fungo Myceliophthora thermophila M.7.7 ao longo do processo de cultivo em estado sólido por 120 horas. As regiões amarelas nas imagens representam a área que o fungo ocupou durante cada tempo de cultivo.

Figura 5.17. Imagem aquisitada no tempo zero de cultivo no estado sólido.

Figura 5.18. Quantificação da área de crescimento de Myceliophthora thermophila M.7.7 em

cultivo no estado sólido no tempo de 24 horas. A

B _B’

76

Figura 5.19. Quantificação da área de crescimento de Myceliophthora thermophila M.7.7 em cultivo no

estado sólido no tempo de 48 horas.

Figura 5.20. Quantificação da área de crescimento de Myceliophthora thermophila M.7.7 em cultivo no

estado sólido no tempo de 72 horas.

Figura 5.21. Quantificação da área de crescimento de Myceliophthora thermophila M.7.7 em cultivo no

77 A análise das Figuras 5.17, 5.18, 5.19, 5.20, 5.21 e 5.22 demonstraram que a partir de 24 horas de cultivo até às 96 horas, ocorreu um crescimento expressivo da biomassa na superfície do meio.

Em 24 horas de cultivo (Figura 5.18) houve 14% de área colonizada pelo fungo, seguido por 36% em 48 horas (Figura 5.19), onde nota-se a intensa colonização da hifa sobre o substrato, evidenciando a fase de crescimento acelerado, conforme foi apresentado nas análises de glicosamina e MEV.

Às 72 horas (Figura 5.20) houve 64% de colonização, e às 96 horas (Figura 5.21) ocorreu um aumento acentuado com 96%, com ocupação de quase toda a superfície do substrato. Não foi possível visualizar a fase estacionária neste período, visto que a taxa de crescimento foi estimada, sem levar em conta o crescimento tridimensional do fungo.

Às 120 horas de cultivo, como apresentado na Figura 5.22, houve um decréscimo na colonização do fungo, atingindo 83% de área colonizada. Tal fato pode ser explicado devido a crescente formação de conídios na superfície do meio, confundindo-se com as hifas. Nessa

Figura 5.22. Quantificação da área de crescimento de Myceliophthora thermophila M.7.7 em cultivo no

78 fase, o avanço do crescimento ocorreu apenas pelo aumento na densidade em áreas do substrato que já foi colonizado. E como demonstrado nas análises por MEV, o crescimento do microrganismo sobre o substrato não é homogêneo, há a formação de microcolônias em pontos específicos do substrato. Esta fase, portanto, passou a ser seguida pelo processo de diferenciação, como o desenvolvimento de hifas aéreas.

A Figura 5.23 refere-se à média de cinco cultivos no estado sólido independentes. Através de uma análise de variância com 95% de significância os cinco cultivos foram estatisticamente iguais, ao passo que o tempo de fermentação teve efeito significativo sobre a concentração de biomassa, e apresentou desvios padrões muito pequenos, o que demostra que a técnica possui uma boa reprodutibilidade. Observa-se uma tendência do crescimento da área recoberta pelas hifas entre os períodos de 24 e 120 h de fermentação, confirmando o que havia sido observado visualmente nas imagens.

Figura 5.23. Análise da área de crescimento do fungo Myceliphthora thermophila M.7.7 em cultivo

79 A técnica de processamento digital de imagens representou uma boa alternativa para estimação da biomassa de Myceliophthora thermophila M.7.7 em cultivo no estado sólido, porém, a técnica necessita ser melhor desenvolvida.

Couri et al (1993), empregaram o método da análise digital de imagens através do

software KS400 (Carl Zeiss Microscopy), para o estabelecimento da cinética de crescimento

do Aspergillus niger 3T5B8 cultivado em sabugo de milho e, paralelamente, acompanharam o crescimento do microrganismo pela determinação de N-acetilglicosamina. Antes das análises químicas serem realizadas, foram realizados testes de iluminação e focalização das imagens. Foi demonstrado que imagens desfocalizadas produziram resultados pouco confiáveis provocando elevados valores de desvio-padrão. Além disso, sendo o sabugo de milho, uma superfície não homogênea, houve uma diferença de contraste entre o fundo e a superfície, mensurando "dados" mesmo quando ainda não houvesse desenvolvimento da hifa, provocando um falso positivo.

A técnica de processamento digital de imagens tem sido melhor desenvolvida em cultivos líquidos, poucas referências são encontradas utilizando tal ferramenta para a avaliação do crescimento de fungos filamentosos em cultivo sólido.