Öneriler

Um aspecto importante na produção de produtos fermentativos a partir da biomassa é o fato de que durante a fase de pré-tratamento do resíduo agroindustrial para produzir o hidrolisado que será utilizado na etapa de fermentação, além da solubilização dos polissacarídeos na forma de seus monômeros e da lignina, é comum ocorrer a formação de outros compostos químicos que podem ser tóxicos aos microrganismos que realizarão o processo de fermentação. Esses compostos tóxicos podem ser divididos em: furanos, que são provenientes da degradação dos açúcares, compostos gerados a partir da hidrólise da estrutura lignocelulósica, compostos fenólicos originários da degradação da lignina e íons metálicos (OLSSON;HAHN-HÄGERDAL, 1996; PARAJÓ et al., 1998; JÖNSON et al., 2013; MONLAU et al., 2014). Os compostos tóxicos podem estressar os microrganismos fermentadores a um ponto em que a eficiência da utilização dos açúcares é diminuída e a formação dos produtos fermentativos é reduzida (MUSSATO;ROBERTO, 2004). O potencial de toxicidade desses compostos está diretamente ligado as suas concentrações no hidrolisado. Além disso, as variáveis do processo fermentativo, tais como as condições fisiológicas das células, a concentração de oxigênio dissolvido no meio e o pH do meio, também estão associadas ao potencial toxicológico desses compostos, sendo que em muitos casos, acentuam esse potencial (TAHERZADEH et al., 2000).

A composição do hidrolisado em relação aos compostos tóxicos depende principalmente do tipo de biomassa utilizada bem como do tipo de pré-tratamento e da severidade em que ele é conduzido (PANAGIOTOPOULOS et al., 2011). A geração dos produtos tóxicos já foi reportada ao se utilizar grande variedade de pré-tratamentos, como por exemplo, microondas (JACKOWIAK et al., 2010), explosão a vapor (DI GIROLAMO et al., 2013), água líquida a quente (SAMBUSITI et al., 2013), água subcrítica (FOX et al., 2003), oxidação úmida (DU et al., 2010) e ácido diluído (RAJAN;CARRIER, 2014). Os compostos tóxicos podem inibir o processo fermentativo para obtenção de diversos produtos, como o etanol (LEE et al., 2013), o xilitol (KELLY et al., 2008), o hidrogênio (CAO et al., 2009) e o butanol (WANG;CHEN, 2011). Recentemente, PANAGIOTOPOULOS et al. (2011) criaram um método para avaliar se um hidrolisado lignocelulósico é adequado para servir como substrato de um processo. Segundo os autores

a razão concentração de açúcares)/(concentração de inibidores), denominada eficiência catalítica, deve ser maior que 1.

Entre os compostos furânicos que podem ser gerados, os principais são o furfural, que é resultado da reação de desidratação das pentoses (xilose e arabinose), e o hidroximetilfurfural (HMF), o qual é originado pela reação de desidratação das hexoses (glicose, galactose e manose) (RASMUSSEN et al., 2014). A formação desses compostos é favorecida sob condições extremas de reação (altas concentrações de ácido, altas temperaturas e pressões), principalmente baixo pH (MONLAU et al., 2012). O furfural é considerado mais tóxico do que o HMF porque na grande maioria das vezes está em maior concentração. A baixa concentração de HMF nos hidrolisados é atribuída a dois fatores: 1) a hemicelulose, por conta das condições empregadas na maioria dos pré-tratamentos, é mais hidrolisada do que a celulose, e como em sua estrutura as hexoses aparecem em pouca quantidade, não há muita matéria-prima disponível para a geração de HMF; 2) alta reatividade do HMF (PALMQVIST;HAHN-HÄGERDAL, 2000b). O mecanismo de inibição desses dois compostos é bastante semelhante. Eles podem inibir o crescimento celular, induzir o dano da estrutura do DNA, inibir a ação de enzimas que participam da via glicolítica, diminuir o rendimento de ATP por massa de célula ou inibir a síntese de RNA (BOYER et al., 1992; PALMQVIST;HAHN-HÄGERDAL, 2000b; LIU et al., 2005; ALMEIDA et al., 2009).

Os compostos fenólicos, como a vanilina e o seringaldeído, são gerados principalmente a partir da degradação da lignina (BARAKAT et al., 2012). Ao contrário dos compostos furânicos, sua formação é facilitada em condições alcalinas (NASEERUDDIN et al., 2013). Os compostos fenólicos são considerados os mais tóxicos de todos os inibidores (PARAJÓ et al., 1998), sendo que os compostos fenólicos de baixa massa molar são mais tóxicos do que os de alta massa molar (PALMQVIST;HAHN- HÄGERDAL, 2000b; KLINKE et al., 2004). Seu mecanismo de inibição ocorre na membrana celular. Os compostos fenólicos são capazes de danificar a membrana. Eles causam a partição e a eliminação da integridade da estrutura membranal, culminando na perda da seletividade e da permeabilidade da membrana. Com isso, os componentes intracelulares podem passar para o meio exterior, prejudicando o funcionamento da célula. Além disso, ocorre a inativação das enzimas utilizadas nas vias metabólicas presentes na membrana, o que acaba por diminuir drasticamente o crescimento celular e a síntese do produto de interesse (HEIPIEPER et al., 2009; PALMQVIST;HAHN-HÄGERDAL, 2000b; CAMPOS et al., 2009; HIERHOLTZER et al., 2013).

O principal composto inibitório gerado a partir da hidrólise da estrutura lignocelulósica é o ácido acético, que é proveniente da hidrólise dos grupos acetil, presentes como grupos pendentes na cadeia hemicelulósica (PANAGIOTOPOULOS et al., 2011). O ácido acético é capaz de inibir principalmente o crescimento celular. O pKa do ácido acético é 4,75 e, como os hidrolisados obtidos geralmente apresentam pH abaixo de 4,75, o ácido acético se encontra em sua forma não-dissociada. Nessa conformação o ácido acético é lipossolúvel e consegue permear para dentro da célula ficando acumulado no citoplasma. O interior da célula apresenta um pH de 7,4, ou seja, maior do que o pKa do ácido acético, fazendo com que ocorra a dissociação desse ácido no interior da célula. Com isso, há um aumento da concentração de H+, e consequentemente, há a diminuição do pH intracelular. É de fundamental importância para a célula manter o pH interno, pois essa diminuição do pH intracelular acaba por inibir as atividades celulares, podendo em alguns casos, levar à morte da célula (PAMPULHA;LOUREIRO-DIAS, 1989; VERDUYN et al., 1992; AXE;BALEY, 1995; IMAI;OHONO, 1995; LAWFORD;ROUSSEAU, 1998). Outros ácidos orgânicos também podem causar inibição da mesma maneira que o ácido acético, como o ácido fórmico e o ácido levulínico. Mas ao contrário do ácido acético, eles não são gerados pela hidrólise da estrutura lignocelulósica, mas sim a partir da degradação do furfural e do HMF sob condições severas (PALMQVIST;HAHN-HÄGERDAL, 2000; JÖNSSON et al., 2003)

Os íons metálicos, principalmente ferro, cromo, níquel e cobre, são provenientes da corrosão dos equipamentos utilizados para realizar o pré-tratamento e acabam se solubilizando no hidrolisado. Seu potencial inibitório está ligado ao fato de que eles podem inibir a ação das enzimas que participam das vias metabólicas realizadas pelas células (WATSON et al., 1984).

A concentração máxima de cada inibidor no hidrolisado sem que ele cause algum efeito inibitório não pode ser estabelecida de uma maneira generalizada com precisão, pois a capacidade inibitória dos compostos citados anteriormente, não depende somente de suas concentrações no hidrolisado, mas também do tipo de microrganismo empregado e sua capacidade de adaptação ao meio contendo inibidores, mas acima de tudo, o efeito sinérgico entre esses compostos impede tal determinação (MUSSATO;ROBERTO, 2004). Essa teoria foi reportada por ZALDIVAR et al. (2000), que demonstraram que a toxicidade do hidrolisado hemicelulósico obtido depois do pré-tratamento ácido da biomassa é resultado das interações entre os efeitos inibitórios dos compostos tóxicos, e não da ação individual de cada composto. Um exemplo disso é que tanto os furanos quanto os

compostos fenólicos são capazes de gerar espécies reativas de oxigênio (H2O2, O2- e OH-), as quais interferem negativamente o metabolismo celular, induzindo a célula ao processo de apoptose. Porém, a geração desses compostos só é prejudicial à célula se furanos e fenólicos estiverem presentes no hidrolisado, pois a ação sinérgica potencializa a produção das espécies reativas de hidrogênio. Quando não há a presença dos dois inibidores, esse efeito inibitório não existe (IBRAHEEM;NDIMBA, 2013).

Os microrganismos possuem mecanismos para se adaptar e crescer em meios com os compostos tóxicos, podendo evitar ou reparar os danos causados por esses compostos (LEE et al., 2012; IBRAHEEM;NDIMBA, 2013). Contudo, o ideal é que os compostos tóxicos sejam eliminados antes do início da fermentação. A técnica mais utilizada para isso são os processos de detoxificação.